2)扩增曲线:一般呈“S型”,如果扩增曲线呈“指数型”(图 2.2,来源:QPCR-如何判断引物设计是否有问题)增长,则说明cDNA浓度过低。 图2.2 扩增曲线问题 3)熔解曲线多峰:在理想情况下,只有特定长度和组成的PCR产物才会产生单个明显的熔解峰。如果PCR反应存在非特异性扩增或污染,则可能会导致多个熔解峰或模糊的熔解峰(...
从文献中获取+NCBI Primer Blast(用的少,需要找到靠谱的文献,其次还要平时积累才行,主要适用于特定生物学过程maker gene panel的RT-qPCR验证,eg:纤维化、炎症等) NCBI gene+Primerbank+NCBI Primer Blast(最方便的方法,且很多引物都有validation溶解曲线的结果,靠谱~,但貌似只有mRNA的,没有lncRNA的;即使靠谱,仍然...
引物设计不求⼈！⼿把⼿教你设计RT-qPCR引物！RT-qPCR 全称 Real-time polymerase chain reaction, 即实时聚合酶链锁反应，是⼀种在DNA扩增反应中，以萤光染⾊剂检测每次聚合酶链锁反应（PCR）循环后产物总量的⽅法。OK～这⾥对RT-qPCR的原理，应⽤及数据分析就不再赘述了，因为今天我们主要讲的是...
总之,RT-qPCR引物设计是确保PCR反应准确性和灵敏度的关键步骤。遵循引物设计的基本原则,如特异性、长度、GC含量、Tm值和避免引物二聚体和发夹形成,研究人员可以设计出适合其特定实验需求的引物。 以下是关于如何优化PCR条件以避免引物二聚体和发夹形成的常见方法: 退火温度:退火温度是PCR反应中引物与模板DNA结合的温度。
通过上期《手把手教你做出RT-qPCR最美曲线(三):逆转录酶,你真的了解吗?》一文的学习,相信大家对逆转录酶有了一定的了解,但选对了逆转录酶并不意味着你的逆转录实验就大功告成,逆转录引物的正确选择也是重要一环。根据不同实验目的,逆转录引物的选择也是大相径庭。接下来,小翌与大家一同学习下逆转录引物的相关...
RT-qPCR可通过一步法或两步法来完成(图1、表1)。一步法RT-qPCR把逆转录与PCR扩增结合在一起,使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。一步法RT-qPCR只需要利用序列特异性引物。在两步法RT-qPCR中,逆转录和PCR扩增过程是在两个管中完成,使用不同的...
RT-qPCR 全称 Real-time polymerase chain reaction, 即实时聚合酶链锁反应,是一种在DNA扩增反应中,以萤光染色剂检测每次聚合酶链锁反应(PCR)循环后产物总量的方法。 OK～这里对RT-qPCR的原理,应用及数据分析就不再赘述了,因为今天我们主要讲的是如何设计出好的PCR引物。
RT-qPCR引物应跨内含子设计,这是由于RT-qPCR以cDNA为模板,扩增片段较小。若不跨内含子设计,则扩增片段可能在同一个外显子内。此时,无论是cDNA还是基因组DNA均能扩增同一片段,导致误差。若跨内含子,则只有cDNA能够扩增,这样就避免了基因组DNA的污染。
定量(RT-qPCR)引物设计 软件:primer primer6.0 单个基因 批量设计 以批量设计为例 1、 放入基因文件 2、依次点击analyze—primer search 弹出以下界面 选择前500bp设计引物,长度>500bp的全部改为500bp,<500bp的不做改动 点击primer parameters 退火温度改为60,长度Length先默认,Amplicon Length80-120,点击search...
qPCR引物设计的好坏,直接关乎着扩增效率高低,产物特异性与否。所以正确设计出好的引物是qPCR成功的第一步。引物设计在满足常规引物设计的原则上还要注意以下原则: 1、目的片段长度控制在100 ~ 300 bp; 2、跨外显子设计,避免基因组DNA的影响; 3、设计的引物需要进行扩增效率的检测,扩增效率达标(90-110%)才可用于...