而进行除此之外的RT-qPCR实验，都可以使用荧光染料法。表1.DNA结合染料法和TaqMan探针法对比 二、实验步骤 图5.RT-qPCR实验步骤示意图，图片来源：bing.com 1.设计引物 RT-qPCR的第一步是对靶基因设计特异性的引物，引物设计的好坏，关乎着扩增效率的高低、产物特异性的与否，所以引物设计是实验成功的第一步。引...
RT-qPCR可通过一步法或两步法来完成(图1、表1)。一步法RT-qPCR把逆转录与PCR扩增结合在一起,使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。一步法RT-qPCR只需要利用序列特异性引物。在两步法RT-qPCR中,逆转录和PCR扩增过程是在两个管中完成,使用不同的优化...
(4) 产物分析：通过琼脂糖凝胶电泳 (RT-PCR) 或荧光信号 (RT-qPCR) 分析扩增效果。此外，一种将 RT-PCR 与 qPCR 相结合的技术，逆转录定量实时 PCR(Reverse transcription quantitative real-time PCR, RT-qPCR)。通过在 qPCR 反应中使用 cDNA 来测量 RNA 水平，从而可以快速检测基因表达变化 (图 4B)。图...
1 qPCR仪器工作原理 qPCR仪器是由荧光定量系统和计算机组成，主要包括这三个反应模块：激发光发射源，接收装置，PCR反应模板。在PCR反应模块中进行qPCR反应，当仪器的激发光发射源发出一定波长的光线，遇到qPCR反应体系中的荧光基团则会反射另外一个波长的光线，此时被接收装置实时接收，接收的数据传送至计算机，计算机...
图2 PCR的基本反应步骤 三、PCR的分类 1.普通 PCR 普通PCR即一代PCR,使用普通PCR扩增仪扩增靶基因,并通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行定性分析。 2.实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR) 实时荧光定量PCR,也叫Real-Time PCR,即二代PCR,是指在PCR扩增反应体系中加入荧光染料或者荧光基团,在整个PCR过程...
1. RT-qPCR的一步法与两步法 1)一步法:将逆转录与PCR扩增结合在一起,使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。由于两步反应都在一个管中完成,因此该方法具有更少的实验误差和移液步骤,减少污染的风险。 2)两步法:将逆转录和PCR扩增过程分开,在两个管中完成检测。需要使用不同的缓冲液、...
经过演化和革新，PCR技术已经发展了三代：普通PCR技术、实时荧光定量PCR技术（qPCR）以及数字PCR（dPCR）技术。图1 PCR仪器的发展历程（Lee NY., 2018）二、PCR的原理 PCR的基本原理与DNA的体内复制相类似，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性、退火和延伸三个基本反应步骤构成：① 模板DNA的...
RT-qPCR 可以按一步法或两步法进行(图1、表1)。一步法检测是在一个反应管和缓冲液中进行反转录和PCR,同时使用反转录酶和 DNA 聚合酶。一步法 RT-qPCR 仅使用序列特异性引物。在两步法中,反转录步骤和 PCR 扩增步骤在独立的管中进行,采用不同的优化缓冲...
图2 PCR的基本原理 图3 PCR的流程步骤 三、PCR的分类 1.普通 PCR 普通PCR即第一代PCR,普通PCR扩增仪即可扩增靶基因,并通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行定性分析。 2.实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR) 实时荧光定量PCR,即Real-Time PCR,即第二代PCR,是指在PCR扩增反应体系中加入荧光染料或者荧光...
RT-qPCR是一种对特定DNA进行定量分析的方法,其原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行荧光定量PCR,在PCR扩增过程中,通过收集荧光信号,对PCR进程进行实时检测。在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,...