仪器:ABI 7500实时荧光PCR仪。 方法:将标准物质(以ORF1ab基因浓度为准)2倍倍比稀释,参考试剂盒最低检测限制备若干梯度浓度样品,每浓度重复20次检测,48h内完成所有检测,结果判定以厂家说明书中要求为准,以具有95%阳性检出率的最低浓度水平作为试剂盒的最低检测限。 实验结果: 注:为避免产生误解,检测结果中厂家...
所建立的一步法多重巢式荧光RT-PCR方法可特异性检出新型冠状病毒和甲、乙型流感病毒,新型冠状病毒的最低检出限约为125拷贝/ml,甲、乙型流感病毒的最低检出限约为250拷贝/ml;检测101份各类呼吸道病原体阳性样本,显示新型冠状病毒和甲、...
事实上先前多个技术规范和工作通知中均已明确提出类似建议(选择灵敏度高的检测试剂)[1-3],但此文件中是第一次明确指出高灵敏检测试剂检出限临界数值为 500 拷贝 /mL。对于目前国家药品监督管理局(NMPA)已批准的新冠病毒RT-PCR法检测试剂而言,大部分试剂说明书中宣称的检测灵敏度是可以满足此要求的,见表1。 表1...
3、RT-PCR 过程的每个步骤中使用的实验室试剂量。 4、选择的 RT-PCR 分析。 不同实验室Ct值比较 由于实验室可能使用不同的 RT PCR 检测,因此无法直接比较在不同实验室获得的 Ct 值。由于灵敏度(检测限)、试剂化学性质、基因靶标、循环参数、分析解释方法、样...
PCR扩增包含了这样几个步骤: (1)高温变性解旋:94-98℃ 20~30s; (2)低温退火:引物结合:50~65℃ 20~40s; (3)中温延伸:70~75℃。 此过程需要的物质:目标DNA(就是前边逆转录的cDNA)、DNA引物、Tag 聚合酶(DNA聚合酶)、脱氧核苷酸。 加好物质后,直接放到PCR仪器中,设置好程序,就可以让PCR自己运行了。一般...
该方法敏感性较高,最低检出限为11copies/μL;与禽类常见病毒核酸均无交叉反应;不同稀释度的重组质粒的检测变异系数为0.1%～1.16%。上述结果表明,本研究建立的禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法比传统病毒分离鉴定方法时间更短,具有敏感性强、特异性高的特点,更适用于禽流感病毒H5、H7、H9亚型快速...
PCR (Polymerase Chain Reaction):聚合酶链式反应,基于碱基互补配对原则放大扩增特定 DNA 片段的分子生物学技术,即将微量的 DNA 指数增加。 qPCR (Quantitative Real-time PCR):实时荧光定量 PCR,一般是 real-time PCR 的简称。指在 PCR 反应中,通过荧光化学物质检测 PCR 循环后的产物总量,反应中需通过内参或外参...
利用分光光度计测定重组质粒浓度为31.5ng/μL，换算为拷贝数9.55×109copies/μL。将重组质粒进行10倍倍比稀释后作为模板，利用建立的RT-PCR方法进行检测。结果显示，该方法最低检测限可达9.55×102copies/μL（图4）。重复性试验 以SADS-CoV cDNA为模板，同一批次选取3个样品，进行3次重复性检验。结果显示（...
4、 RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号,可以将消化液稀释10-100倍后使用。可能问题出在标本的保存:一般四小时之内就应处理,分离出细胞说的是套式PCR,可以在你的第一次PCR两个引物内,再设计一对引物进行第二次PCR就行了如果你的第一次PCR刚好包括目的片段,那只好设计个更长的了第二次的引物设计要求...