设计引物时尽量避免出现4个或超过4个G碱基。 RT-PCR实验阴性对照 反转录阴性对照应包括在所有的RT-PCR的实验中,用来检测DNA是否污染(如基因组DNA或PCR产物)。该对照所指不加反转录酶,通过反转录过程得到cDNA在进行荧光定量PCR检测。如检测到扩增,则样本中可能含有基因组...
RT-PCR引物设计原则端不要出现2个或更多碱基的互补扩增产物大小 RT-PCR引物设计原则 RT-PCR引物设计原则 引物长度: 17-25bp GC含量:45-55% Tm:上下游引物Tm值相差不能太大 Oligo:63-68℃Primer3:60-65℃ 序列:碱基要随机分布,尽量均匀 避免出现GC或AT富含区(尤其3' 端) 避免出现多聚嘧啶、多聚嘌呤 3'...
PCR不仅要求引物与靶DNA特异结合,还要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸(图1)。 图1 PCR实验原理 ◆ 引物设计要遵循以下原则 ◆ 01.引物长度一般在15-30bp; 02.引物GC含量一般为40%-60%; 03.引物所对应的模板序列的Tm值最好在50-65℃左右; 04.引物3’端不可修饰,而且避免出现3个以上的连续碱基、互补...
不同的实验条件可能需要不同的引物设计。就像不同的天气要穿不同的衣服一样,得灵活应变。 设计好了引物,还得去验证一下,看看效果咋样。这就跟新做了一件衣服,得试试合不合身呀。要是不合适,就得赶紧调整。 总之,RT-PCR引物设计可不是件容易的事儿,得用心、细心、耐心。这就像是一场战斗,咱得做好充分的...
1.上下游引物要保守: 为了能够扩增出所需要的保守片段,必须对保守的100-200片段进行pcr扩增。所以引物的选取也要非常的保守,最好不要有不同的碱基,若不得不有时,也必须保证引物的3’端至少有4个碱基是完全保守才可。 在设计保守引物时,要在发表序列上分别找保守一致的区域,即在发表序列的5’端引物位置找的是...
RT-PCR引物设计原则和方法第五项为falseprimingsites即错误引发位点在primer5中虽然也有falsepriming分析但不如oligo详细并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率一般的原则要使错误引发效率在100以下当然有时候正确位点的引发效率很高的话比如达到400500错误引发效率超过100幅度若不大的话也可以接analyze中有参考价值的...
RT-PCR引物设计及注意事项 第四讲RT-PCR引物设计及注意事项 D 1 一、步骤1.查找目的基因序列 D 2 D 3 D 4 D 5 D 6 D 7 D 8 目的序列的选择 D 9 TNFalpha用全称 D 10 小鼠的TNFalpha序列 D
RT-PCR法则 PCR引物设计 PCR引物设计的11条黄金法则 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该 引物长度（primer length）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不...