随着反应的进行，有双链形成之后，染料就会与之结合，每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去，产生较强的荧光信号，且信号强度与PCR产生的DNA总量成正比，所以荧光信号的强度能反映出体系中双链DNA的浓度。图2.荧光染料嵌合法原理 染料法操作简单、灵敏度高且成本较低，被广泛地应用于科研中对目的基因定量...
进行PCR时,TaqMan探针可特异地复性杂交到 PCR 产物上。Taq 酶在链延伸过程中遇到与模板结合的 TaqMan探针,其 5'→3'外切酶活性将探针降解,使荧光报告基团与淬灭基团分开,破坏了 FRET,从而产生荧光信号,信号强度与PCR过程中扩增得到的靶DNA产物量成正比。因为只有靶序列与探针互补时荧光信号才会增加,所以不会检测到非...
图1 PCR产物检测的琼脂糖凝胶电泳 观察结果: ① 是否有扩增产物。 ②如有拖尾或有几条区带,说明有非特异性扩增。 ③分子量标准电泳后区带是否分开。 ④与分子量标准比较,PCR产物的长度是否正确。 ⑤PCR产物的产量。 ⑥引物二聚体。 RT-PCR检测人β-actin基因表达 扩增产物长度 260 bp 问题及解决方法 无...
(图6 实验室中RT-PCR扩增目的片段实际设置情况) 2.4 RT-PCR扩增序列电泳检测 电泳检测目的基因,主要使用琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis),在碱性条件下(TAE 作为缓冲液)是得DNA带上负电,进而检测目的片段的大小(图7)。根据DNA分子片段的大小和形状不同,在电场中泳动的速率也不相同,同时在样品中加入核...
3、微流体毛细管电泳系统(分析 RNA 浓度和完整性) 目前已经有成熟并广泛应用的生物分析仪,如 Agilent 2100、Experion™ 自动电泳工作站等。 此外还可以采用 3`:5` assay(检测提取产物中 GAPDH mRNA 的完整性来代表所有 RNA 的完整性,分析 RNA 完整性)、SPUD assay (分析 PCR 抑制剂)、NRT PCR assay(分析 ...
半定量RT-PCR参照的做法一般有两种：1) 将要比较的两个样品的BETA-ACTIN 调成一样的亮度，然后就可以直接比较目的基因的亮度了。方法的结果比较直观，但较费事。2) 不进行调平，一个样品里将目的基因和BETA-ACTIN直接比较，用软件就可以做到，然后将不同样品的这个比值进行比较就可以了。方法比较...
1 RT-PCR 中南大学生命科学学院 2 熟悉RT反应的原理;掌握RT反应的操作步骤 熟悉PCR反应的原理 掌握PCR反应的操作步骤以及PCR反应参数的选择与优化 掌握PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测方法 3 RT反应:在逆转录酶作用下,以mRNA为模板合成cDNA(complementaryDNA)分子的过程。 PCR反应:PCR扩增是模拟天然DNA复制过程,利用DNA...
3、微流体毛细管电泳系统(分析 RNA 浓度和完整性) 目前已经有成熟并广泛应用的生物分析仪,如 Agilent 2100、Experion™ 自动电泳工作站等。 此外还可以采用 3`:5` assay(检测提取产物中 GAPDH mRNA 的完整性来代表所有 RNA 的完整性,分析 RNA 完整性)、SPUD assay (分析 PCR 抑制剂)、NRT PCR assay(分析 ...
qPCR实质上是一种PCR扩增反应，但它与普通PCR有所不同。普通PCR是将的得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过核酸染料染色并借助紫外凝胶成像仪进行观察，最后通过终产物进行定性或者半定量分析；qPCR是在反应体系中引入荧光基团（染料或者探针），进而对qPCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应的过程，结合相应的qPCR仪...