1. Total RNA was extracted using a Trizol reagent (Invitrogen). RNA (2 μg) was converted into cDNA using the RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo). QRT-PCR was accomplished using the FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) (Roche) in the ABI PRISM® 7300 real-time PCR...
实时荧光定量PCR(RT-qPCR) ,是指在PCR反应体系中加入荧光标记物,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过扩增曲线对未知模板进行定量分析的方法。一般用于mRNA转录水平的定量研究、不同样本或基因组中DNA拷贝数的测定、基因芯片结果验证、药效分析等。 载基采用SYBR荧光染料法进行荧光定量PCR检测,从引物设计到检测...
定量ＲＴ－ＰＣＲ是在用一步法或两步法，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。有相对定量和绝对定量两种分析方法，绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中...
2 病原体检测：采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。3 药物疗效考核：对乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型...
14.定量PCR:通过测定PCR反应体系中初始DNA的数量,可以计算出初始样品中的目标DNA的初始数量。 15.实时荧光定量PCR:结合荧光染料和合适的探针,可以实时监测PCR反应体系中目标DNA的扩增过程。 结论 RT-PCR实验是一种重要的分子生物学技术,能够在体外合成DNA的互补链。通过逆转录反应和PCR扩增,可以获得目标DNA的大量复制...
一. RT-qPCR 基本原理和概念实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 以cDNA 为模板进行 PCR,在 PCR 扩增过程中,通过收集荧光信号,对 PCR进程进行实时...
具体原理见下图。通过 PCR 反应生成双链 DNA,TB Green 与双链 DNA 结合发出荧光,通过检测PCR 反应液中的荧光信号强度,可以对目的基因进行准确定量,同时还可以测定扩增的目的 DNA 片段的融解温度。 反应体系的配制和PCR仪还有关系,不同的PCR仪,配制PCR 反应液可能不同,具体参照试剂的说明书和按照不同仪器的操作...
分别提取不同批次的3个阳性样品，每个样品3个重复，进行3次重复测定，验证RT-PCR的可靠性。临床检测 使用RNA提取试剂盒提取21份病料样品总RNA，利用建立的RT-PCR方法进行检测，并以SADS-CoV提取的RNA作为阳性对照。RT-PCR产物以1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果 特异性扩增引物的选择 以SADS-CoV的阳性质粒、...
1、如果模板为真核生物来源,且后期cDNA用于常规PCR扩增,建议选择Oligo(dT);若后续实验仅用于qPCR,建议将Oligo(dT)与随机引物混合后使用,可提高反转录效率。 2、如果模板为原核生物来源,反转录请选用Random Primers 或者基因特异性引物。 荧光定量 荧光定量主要从定量方法的选择、引物设计原则、ROX的选择、反应体系的...
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时检测。 2、实时定量PCR技术: 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 3、如何对起始模板定量?