由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以可以定量。 Ct值 Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 (cycle)。 qRT-PCR在扩增的时候都会有平台期,在平台期之前,PCR 扩增就是简单的指数增长,也就是 1 变 2,2 变 4,4 变 8 …扩增。数学形式...
本实验室用的是 Applied Biosystems 的仪器,参考试剂盒中 Applied Biosystems 7500 and 7500 Fast Real-Time PCR System 和 StepOnePlus Real-TimePCR Systems 的操作方法。 使用StepOnePlus Real-Time PCR System 时,ROX Reference Dye (50X)添加量为 PCR 反应体系的 1/50。考虑到吸取误差,配置的预混液体积要至...
从理论上看,PCR的扩增可以分成以下三个阶段,指数扩增、线性扩增、平台期。 当试剂量足够的时候,就处于指数扩增阶段,只有当PCR试剂不足时,才进入线性扩增期,最后当试剂被耗尽时,产物不增长,位于平台期。 在我们的实验中,通常PCR反应是处于指数增长期。我们将其进行对数处理,指数增长就会变成线性增长,这样数据的右偏...
youtube【科普教程】RT-qPCR(实时荧光定量PCR)的数据计算(上), 视频播放量 1411、弹幕量 0、点赞数 10、投硬币枚数 0、收藏人数 22、转发人数 0, 视频作者 朱墨老师, 作者简介 大学副教授,硕士生导师,相关视频:【科普教程】RT-qPCR(实时荧光定量PCR)的数据计算(下
qPCR-定量PCR-Graphpad 作图教程-数据作图 计算步骤: 一般一种处理即需要一个内参,同一个处理的多个基因可以共用一个内参。 内参Ct计算均值(可选); 目的基因 - 内参均值 = dCt;(可以按replicate相减,不用均值) 处理- 对照 = ddCt; Log2FC = -ddCt; ...
根据基因表达量的计算公式,基因表达量=2^-△△Ct,其中△△Ct=△Ct(实验组)-△Ct(对照组) 例如: 验证基因A的敲低效果,实验分为两组:对照组和实验组。每个样本设置三个复孔,通过PCR仪的检测得到Ct值,先根据公式计算出△△Ct值,再计算出基因的表达量,取对照组的表达量的平均值,让所有的数据除以平均值,这样...
通常我们在拿到RT-PCR结果时会使用△△Ct法计算相对表达量,然后通过T-test进行差异检验。但t-test它预设数据是符合正态分布的,有时候我们的数据并不符合正态分布。此时我们使用像秩和检验这种非参数检验就比较合适。 *客官老爷请视察小云公号云生信学生物信息学,里面藏着980多篇的日更,原创干货,还可做各种意想不...
RT-PCR数据分析RT-PCR数据分析方法(相对定量) 1.以质量单位作为标准进行相对定量 条件:要求准确地量化初始材料,如细胞数目或核酸的微克数。 当用相对定量法比较多个样本时,选择一个样本作为校验样本(Calibrator,即对照),所有样本目标基因的表达都以对照为标准上调或下调。通常用未处理作为对照。 用试验样品和对照样品...
RT-PCR 的具体数据就是基线(baseline),荧光阈值(threshold)和Ct 值。 RT-PCR的常见标记方法: 二、实验步骤 2.1 关于实验分组——组内要有复孔,要有生物学重复。 2.2 关于引物设计的原则 ①siRNA具有物种特异性,不同的物种序列会不一样。 ②siRNA是冻干粉包装,室温下能稳定保存2-4星期。