相当于重新标准化的文库,保证每个样本中所有TPM的总和是相同的。 TPM与RPKM/FPKM的区别:从计算公式来说,唯一的不同是计算操作的顺序,TPM是先去除了基因长度的影响,而RPKM/FPKM是先去除测序深度的影响,具体可看这篇博文,有计算步骤的详细说明;TPM实际上改进了RPKM/FPKM方法在跨样品间定量的不准确性。 TPM的使用范...
和前面一样,使用的数据依然来自GSE145894,使用STAR进行比对,然后使用StringTie获取其Count值和FPKM以及TPM值。对于Count值,使用DESeq2,而对于FPKM值,在log2之后使用limma进行差异分析。为避免固定阈值导致的误差,我使用mean(logFC)+2*sd(logFC)作为差异阈值,以P<0.05作为显著性阈值。 下面,进入我们的正题部分。 1、...
中间的PCA图,说明我们的normal和npc两个分组非常明显的差异 右边的层次聚类也是如此,说明我们的normal和npc两个分组非常明显的差异 如果分组在3张图里面体现不出来,实际上后续差异分析是有风险的。这个时候需要根据你自己不合格的3张图,仔细探索哪些样本是离群点,自行查询中间过程可能的问题所在,或者检查是否有其它混杂...
这样下次就不需要重新运行所有分析了。保存 Seurat 对象的方法与保存其他 R 对象一样。可以使用saveRDS/r...
FPKM (Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads):即每百万映射读片段的每千碱基读数。这与 RPKM 类似,但用于成对的测序读数,其中两个读数表示一个片段。 手画数量比例 六种数据的大概对应 2.DESeq2,EdgeR和limma是三种R语言中常用的差异表达分析工具包,可以用于分析RNA-seq或microarray等高...
事实也证明TPM的标准化方法更有优势,目前都已经推荐进行TPM标准化,不再使用了RPKM、FPKM了。 CPM:Counts per million (CPM) mapped reads,只对测序文库(每个样本总reads数)标准化,而不对长度标准化。这是因为,差异分析往往是同一基因在两组或多组样本量的差异,因此不必在计算单位长度基因的表达量。
1)由于可变剪切,同一基因有效转录区域长度未必相同(这个一般情况下可以不考虑,了解一下:Cufflinks软件考虑了这个问题)优化策略:外显子或转录本水平的表达量分析。 2) 使用reads数计算基因表达量有轻微误差(这里暂不展开,主要了解一下定义)优化策略:FPKM或 TPM ...
数据分析 在获取到干净的数据之后,可以进行reads的比对,然后进行基因表达的量化、差异表达分析、功能富集分析等 高级分析 包括数据的可视化,其他小分子RNA分析、融合分析以及与其他类型的数据进行整合分析等 而我们分析的起始点,是从原始数据开始的,也就是获取raw reads数据。通常这种高通量测序数据会保存为FASTQ格式的文...
RPKM VS FPKM RPKM vs FPKM 对于PE,如果一对paired-read都比对上了,那么这一对pair-read称为一个fragment;如果一个比对上了,另一个没比对上,那么这个比对上的read就称为一个fragment。 TPM TPM: Transcripts Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts...