RPM适合于产生的read读数不受基因长度影响的测序方法,比如miRNA-seq测序,miRNA的长度一般在20-24个碱基之间。 RPKM/FPKM (Reads/Fragments per kilo base per million mapped reads) RPKM/FPKM方法:10^3标准化了基因长度的影响,10^6标准化了测序深度的影响。FPKM方法与RPKM类似,主要针对双末端RNA-seq实验的转录本...
基于PacBio技术的Iso-Seq能够检测长达15 kb的全长转录本cDNA reads,这有助于发现大量先前未注释的转录本,并通过全长测序确认了早期基于跨物种同源序列的基因预测结果。在标准的Iso-Seq实验流程中,模板置换逆转录酶可以将高质量RNA转化为用来测序的全长cDNA。然后将得到的cDNA进行PCR扩增,并构建PacBio单分子实时(sing...
RNA-seq:用于RNA层面的研究,包括RNA结构组学等,常用于检测所有mRNA的表达量差异。基本步骤包括:提取RNA,富集mRNA合成cDNA并构建文库测序,比对reads,计算reads数定量(测序reads深度10-30Million reads)。1…
该基因的reads数 / 该基因的长度(即count) count / 总reads数 FPKM v.s. TPM 两者的区别在于计算的顺序不同。 数学上其实是一致的,但是实际运用中,由于除不尽、近似等缘故,造成误差。调整计算顺序后,有助于减小误差。 举例:RNA-Seq分析|RPKM, FPKM, TPM, 傻傻分不清楚? 结论 RNA-seq分析时,一般使用TPM...
但实际上,随着测序单价的下降,目前市场上RNA-seq类项目的单样本测序量正在不断提高。以2G,PE100测序的表达谱项目为例,其对应的测序量为20M条reads。如果一条长度为1kbp的低表达基因的表达量为RPKM=0.5,其理论上可以检测到的reads数为20×0.5=10。所以低丰度基因的检测,对RNA-seq这个技术来说并非最大问题。
一、不同平台 RNAseq 研究的比较 在前面介绍过不同测序平台的优势,目前市场上主流测序平台主要包括短读长测序的 illumina 测序平台,华大基因的 MGI 测序平台,长度长测序的 Pacbio 测序以及牛津纳米孔 nanopore 测序。在 ncbi 的 sra数据库中,目前超过 95%的的数据均来自于 illumina 测序,这一方面是由于 illumina ...
1.1 RPKM(Reads Per Kilobase Million) 字面理解:RPKM(Reads Per Kilobase Million)的分子是reads计数,分母是Kilobase和Million。故需要除以Kilobase和Million,reads对应的是RNA-seq中,某基因匹配到的reads计数,Kilobase对应的是基因的长度,而Million对应的是测序深度...
在RNA-seq上游的流程中,所得到的产物为表达矩阵,各个样本比对到参考基因组中各个基因的reads数,一般成为raw read count,这也是最简单的表达定量形式。在同一个样本中,不同的RNA可能有不同长度,长度越长,对应的reads就越多;在不同的样本中,它们可能有不同的测序深度,深度越深,对应的reads也越多。不同样本的raw...
常用的RNA-seq操作平台有Illumina GA/ HiSeq, SOLiD 还有Roche 454。它们都是提取RNA后,纯化,打碎,逆转录成cDNA,然后测序。测序的结果被称为short reads。通常一个reads的长度为25-300bp之间。如果测序只测一端可能会带来比对时的困难,于是这些操作平台提供了两端都测的办法,这样的结果成对出现,中间有一定的间隔...