RNA-seq:用于RNA层面的研究,包括RNA结构组学等,常用于检测所有mRNA的表达量差异。基本步骤包括:提取RNA,富集mRNA合成cDNA并构建文库测序,比对reads,计算reads数定量(测序reads深度10-30Million reads)。1…
基于PacBio技术的Iso-Seq能够检测长达15 kb的全长转录本cDNA reads,这有助于发现大量先前未注释的转录本,并通过全长测序确认了早期基于跨物种同源序列的基因预测结果。在标准的Iso-Seq实验流程中,模板置换逆转录酶可以将高质量RNA转化为用来测序的全长cDNA。然后将得到的cDNA进行PCR扩增,并构建PacBio单分子实时(sing...
对于已知的isoforms,建议每个样品至少有3000万reads且配对。 研究新的isoform需要更大的深度(6千万reads)。 还是那句话,生物学重复更重要。 read长度越长越好。 对RNA质量进行细致的质量控制。注意使用高质量的制备方法,并限制对高质量的RIN样品进行分析。 其他类型的RNA分析(内含子,小RNA-seq等): 根据具体情况设定。
通常建议读取长度 >= 50 bp 含有低表达基因: 同样,重复比测序深度更有作用。 深度更深,至少有 30-60 百万reads,具体取决于表达水平。 异构体水平的差异表达: 新亚型的深度应该更大(每个样本 > 6000 万reads)。 对RNA质量进行质控。 其他类型的RNA分析(内含子保留、small RNA-Seq等): 取绝于具体的分析 总之...
RPM (Reads per million mapped reads) RPM方法:10^6标准化了测序深度的影响,但没有考虑转录本的长度的影响。 RPM适合于产生的read读数不受基因长度影响的测序方法,比如miRNA-seq测序,miRNA的长度一般在20-24个碱基之间。 RPKM/FPKM (Reads/Fragments per kilo base per million mapped reads) ...
Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads,代表每一百万条可以比对到基因组上的Read当中,有几条是可以比对到某个特定基因的,然后这数值再除以该基因的外显子的长度,得到的这样一个最终的比值。即某一基因的counts先除以测序深度(总reads数),再除以基因长度。公式如下: ...
但实际上,随着测序单价的下降,目前市场上RNA-seq类项目的单样本测序量正在不断提高。以2G,PE100测序的表达谱项目为例,其对应的测序量为20M条reads。如果一条长度为1kbp的低表达基因的表达量为RPKM=0.5,其理论上可以检测到的reads数为20×0.5=10。所以低丰度基因的检测,对RNA-seq这个技术来说并非最大问题。
1.1 RPKM(Reads Per Kilobase Million) 字面理解:RPKM(Reads Per Kilobase Million)的分子是reads计数,分母是Kilobase和Million。故需要除以Kilobase和Million,reads对应的是RNA-seq中,某基因匹配到的reads计数,Kilobase对应的是基因的长度,而Million对应的是测序深度...
在RNA-seq上游的流程中,所得到的产物为表达矩阵,各个样本比对到参考基因组中各个基因的reads数,一般成为raw read count,这也是最简单的表达定量形式。在同一个样本中,不同的RNA可能有不同长度,长度越长,对应的reads就越多;在不同的样本中,它们可能有不同的测序深度,深度越深,对应的reads也越多。不同样本的raw...
RNA-seq文库的测序读长分配到每个样本上的话,每个样本会测到平均20-30 million条读长(reads)(也就是常说的20-30M条读长),数据经过处理后,使用这些读长对每个基因或转录本进行定量,最后再用统计学方法来统计基因的差异。短读长RNA-seq方法很稳健,并且通过对短读长测序技术的大范围比较发现,这种技术在平台内和...