基于PacBio技术的Iso-Seq能够检测长达15 kb的全长转录本cDNA reads,这有助于发现大量先前未注释的转录本,并通过全长测序确认了早期基于跨物种同源序列的基因预测结果。在标准的Iso-Seq实验流程中,模板置换逆转录酶可以将高质量RNA转化为用来测序的全长cDNA。然后将得到的cDNA进行PCR扩增,并构建PacBio单分子实时(sing...
RNA-seq:用于RNA层面的研究,包括RNA结构组学等,常用于检测所有mRNA的表达量差异。基本步骤包括:提取RNA,富集mRNA合成cDNA并构建文库测序,比对reads,计算reads数定量(测序reads深度10-30Million reads)。1…
RNA-seq文库的测序读长分配到每个样本上的话,每个样本会测到平均20-30 million条读长(reads)(也就是常说的20-30M条读长),数据经过处理后,使用这些读长对每个基因或转录本进行定量,最后再用统计学方法来统计基因的差异。短读长RNA-seq方法很稳健,并且通过对短读长测序技术的大范围比较发现,这种技术在平台内和...
关于读段(reads):DNA簇的数目约等于reads的数目,测序周期数目约等于reads的长度。 RNA-seq全流程和细节探讨 1. 技术流程概括: RNA-seq技术流程可概括如下图,主要包括建库、扩增和测序三大板块。 原创 2. 接头序列(Adapter)的功能: (1)在cDNA文库构建板块中Adapter的功能是充当文库PCR扩增的引物,这次PCR扩增的目的...
在RNA-seq上游的流程中,所得到的产物为表达矩阵,各个样本比对到参考基因组中各个基因的reads数,一般成为raw read count,这也是最简单的表达定量形式。在同一个样本中,不同的RNA可能有不同长度,长度越长,对应的reads就越多;在不同的样本中,它们可能有不同的测序深度,深度越深,对应的reads也越多。不同样本的raw...
通常建议读取长度 >= 50 bp 含有低表达基因: 同样,重复比测序深度更有作用。 深度更深,至少有 30-60 百万reads,具体取决于表达水平。 异构体水平的差异表达: 新亚型的深度应该更大(每个样本 > 6000 万reads)。 对RNA质量进行质控。 其他类型的RNA分析(内含子保留、small RNA-Seq等): ...
但实际上,随着测序单价的下降,目前市场上RNA-seq类项目的单样本测序量正在不断提高。以2G,PE100测序的表达谱项目为例,其对应的测序量为20M条reads。如果一条长度为1kbp的低表达基因的表达量为RPKM=0.5,其理论上可以检测到的reads数为20×0.5=10。所以低丰度基因的检测,对RNA-seq这个技术来说并非最大问题。
在常规RNA-seq应用中最主要的当然还是以DGE分析为主,通常每个样本会测20-30 M的reads数进行高质量的DGE分析。此外,由于常规RNA-seq对整个转录本的序列进行打断后测序,其覆盖了转录本的完整信息(图4),因此除了最主要的DGE分析外,它可以进行转录本的de novo组装,Isoform的检测、定量以及基因融合的分析(图2)。对于...
RPKM/FPKM (Reads/Fragments per kilo base per million mapped reads) RPKM/FPKM方法:10^3标准化了基因长度的影响,10^6标准化了测序深度的影响。FPKM方法与RPKM类似,主要针对双末端RNA-seq实验的转录本定量。在双末端RNA-seq实验中,有左右两个对应的read来自相同的DNA片段。在进行双末端read进行比对时,来自同一DN...
Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads,代表每一百万条可以比对到基因组上的Read当中,有几条是可以比对到某个特定基因的,然后这数值再除以该基因的外显子的长度,得到的这样一个最终的比值。即某一基因的counts先除以测序深度(总reads数),再除以基因长度。公式如下: ...