二、测序深度 概念:测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值,可以理解为基因组中每个被测到的碱基重复被测序的的平均次数(以碱基数量为单位) 测序深度计算= reads长度 × 比对的reads数目 / 参考序列长度 一般用途:深度越大,每个碱基测序次数越多,越增加对低频变异的检出率,一般选择测序深度可结合具体的需求而定...
我们一般的RNA-seq要测的,也是mRNA的各种变化,所以,在实验过程当中,我们一般要把核糖体RNA先去掉。然后再进行建库测序。 去除核糖体RNA,并进行建库的方法有许多种。目前应用最广泛的是illumina公司的TruseqRNA建库方法。 上图是mRNA测序的建库过程图。 首先,利用高等生物的mRNA都有Poly(A)尾巴这个特点,用带有Poly(T...
浅谈RNA-seq RNA-seq:用于RNA层面的研究,包括RNA结构组学等,常用于检测所有mRNA的表达量差异。基本步骤包括:提取RNA,富集mRNA合成cDNA并构建文库测序,比对reads,计算reads数定量(测序reads深度10-30Million reads)。 1. 生物体中总RNA=(～90%)rRNA+ (1～2%)mRNA+(8～9%)其他RNA,因而我们首先去除提取到总RNA中...
对于每个基因,使用中位数回归估计整块和单细胞RNA-seq数据集在归一化前后的计数与测序深度关系。(a)左图显示了在一个大的RNA-seq数据集中对3个基因未归一化表达与对数测序深度估计回归,不包含零测量值,低、中、高表达定义分别为非零未归一化测量...
在RNA-Seq的分析中,对基因或转录本的read counts数目进行标准化(normalization)是一个极其重要的步骤,因为落在一个基因区域内的read counts数目取决于基因长度和测序深度。很容易理解,一个基因越长,测序深度越高,落在其内部的read counts数目就会相对越多。当我们进行基因差异表达的分析时,往往是在多个样本中比较不同...
DESeq2-归一化计数:比值中位数法 由于差异表达分析的工具是比较同一基因的样本组之间的计数,分析工具不需要考虑基因长度。然而,分析确实需要考虑测序深度和RNA组成。 为了对测序深度和RNA组成进行归一化,DESeq2使用了比率中位数法。在用户端只有一个步骤,但在后端有多个步骤,如下所述。
可以看出TPM是先对基因长度标准化,再对测序深度标准化,这与FPKM正好相反。 TPM vs RPKM TPM vs RPKM TPM vs RPKM TPM vs RPKM 个人理解:由于标准化顺序的不同,导致TPM的pie是一样的,而RPKM的pie是不一样的。 statquest:with TPM, everyone gets the same sized pie. since RNA-seq is all about comparing...
RPKM与FPKM的区别:RPKM值适用于单末端RNA-seq实验数据,FPKM适用于双末端RNA-seq测序数据。 RPKM/FPKM适用于基因长度波动较大的测序方法,如lncRNA-seq测序,lncRNA的长度在200-100000碱基不等。 TPM (Transcript per million) TPM的计算方法也同RPKM/FPKM类似,首先使用式2计算每个基因的表达值,去除基因长度的影响。随...
字面理解:RPKM(Reads Per Kilobase Million)的分子是reads计数,分母是Kilobase和Million。故需要除以Kilobase和Million,reads对应的是RNA-seq中,某基因匹配到的reads计数,Kilobase对应的是基因的长度,而Million对应的是测序深度。 Step 1:对每个样本的测序深度进行标...
RNA-seq可以从核酸层面为各种生物研究提供支持,最常见的就是实验处理下差异表达基因的筛选;并且随着测序成本减少,RNA-seq已经是大多数实验的标配。 有时候,项目经费有限的情况下,我们应该怎么设计实验,尽可能地达到实验目的,需要考虑到实验重复和测序深度的选择。