如果qPCR 验证的结果与RNAseq的结果不一致，需要从qRT实验和RNAseq数据两方面同时考虑。在qRT实验方面，考虑的因素有：1. 反转录cDNA的时候是用的Ransom primer还是OligodT, 是否和RNAseq反转录的方法一致。2. 引物跨内含子设计。3. RNA引物设计的特异性。引物质量的好坏可以从融解曲线来判断。当融解曲线只有一个峰...
所以这就是两种方法的区别,qPCR的定量是在基因的局部区域测量的,RNA-seq的定量是在基因的全长区域测量的。因此,qPCR和RNA-seq在基因表达定量上的区别,就会导致它们在估算基因表达水平改变时的产生冲突,但是并不代表着其中一种方法的结果有误。尽管RNA-seq存在偏倚,但就目前的技术来看,假阳性结果其实概率很低了。 ...
图2. RNA-seq与qPCR结果的相关性图 接着计算MAQCA 和 MAQCB两者之间差异基因的表达情况,85%的基因在测序和qPCR结果中保持一致,如图3所示。由此可以推算出18080个蛋白编码基因中可能有2712个基因的表达量计算结果不准确。 图3. 差异表达基因的RNA-seq与qPCR结果相关性图。 而对于不同算法,都出现了一些特定基因表...
可能是因为你做qPCR的样本状态和你做RNA测序的样本状态不一致导致的，因为基因的表达量受环境的影响是很...
在RNA-Seq分析中,许多基因往往会产生多个转录本,且某些转录本形式相对复杂。因此,如果引物设计不当,可能会导致qPCR结果的不准确,甚至受到假基因的干扰。因此,建议在设计qPCR引物时,尽量选择位于转录本共有外显子上的引物,而不是特定转录本。引物设计完成后,可以利用Omicsmart平台的BLAST分析模块进行Primer Blast,以...
seq与qpcr之间可以有差距，但不能太大甚至相反。但是，我的问题是如果seq与qpcr不一致怎么办？或者说，...
因为RNA-Seq测序数据得到的结果作为定量参考,参数的改变也会造成结果的不同。所以需要进行qPCR验证,表达水平的结果最终以实时定量PCR为准。 一般需要验证基因的数目:20个左右 在验证时,往往会出现RNA-Seq测序结果和QPCR结果不一致的情况,遇到此类情况,因为这是正常现象(活久见)。
(1)实验样本搞反导致的结果; (2)没有使用与RNA-seq同一批样本进行验证; (3)挑选的基因表达差异并不显著,或者挑选的是差异基因但表达量较低; (4)两种方法本身就不同,RNA-seq是大规模筛选用的,反应样本整体的基因表达变化趋势,但不能保证每个基因的变化趋势都与qPCR一致。存在一定量的不一致情况也属正常。
首先,我们需要对转录组和qPCR一致性有一个合理预期:这两个实验方法本身存在差异,因此存在一定程度的不一致性(约30-40%)是正常的情况[1]。在Huang J等人的研究中,出现转录组和qPCR结果的不一样(甚至趋势相反的情况),文章也对这种情况进行了探讨[2]。
批次效应对于WB、qPCR影响较小，但对高通量测序的影响较为显著，不建议老师们一个项目分开准备样本，建库和测序哦，批次效应虽然可以用技术手段进行缩小，但是是很难去除的哦。参考文献 1. Impact of RNA degradation on next-generation sequencing transcriptome data2. RNA-seq: impact of RNA degradation on ...