总体来说,基因的本身特征如基因长度,GC含量等,RNA-seq的建库方式以及基因表达量算法均会影响基因的表达量计算,使计算出的表达量与实际有所出入,从而与qPCR的定量结果之间存在差异。如若二者结果出现相反,也在情理之中。这也是任何一个技术获得结果之后需要多方验证的原因之一。 参考文献 [1] Bias detection and corre...
所以这就是两种方法的区别,qPCR的定量是在基因的局部区域测量的,RNA-seq的定量是在基因的全长区域测量的。因此,qPCR和RNA-seq在基因表达定量上的区别,就会导致它们在估算基因表达水平改变时的产生冲突,但是并不代表着其中一种方法的结果有误。尽管RNA-seq存在偏倚,但就目前的技术来看,假阳性结果其实概率很低了。 ...
转录组测序是基于检测样品里所有基因整体上的表达情况,qPCR是特异性设计引物对基因的局部区域做相对定量的,两者的技术原理是存在一定不同的,所以转录组和qPCR确实有可能存在并没有非常一致的情况的,一般来说主要看大部分基因的趋势一致就行的。 备注(一种比较特别的情况): 为什么敲除基因A的2号外显子后,K组的表达...
引物好用，用qPCR更准确。引物不好用，用RNAseq。RNAseq主要限制在于测序深度，如果你的基因丰度不高，...
因为多种方法交叉印证得到的结论比单一方法得到的结论靠谱。
做完RNA-seq测序分析之后,需要做QPCR来验证测序结果的准确性。关于QPCR数据的分析计算方法,小编在之前的推文中已经讲过了(qRT-PCR相对定量计算详解)。今天小编就给大家讲一下QPCR与RNA-seq结果相关性图的绘制。 数据准备 首先需要把QPCR的相对表达量以及RNA-seq测序的差异结果提取并整理成如下格式。需要注意的是,为了...
因为RNA-Seq测序数据得到的结果作为定量参考,参数的改变也会造成结果的不同。所以需要进行qPCR验证,表达水平的结果最终以实时定量PCR为准。 一般需要验证基因的数目:20个左右 在验证时,往往会出现RNA-Seq测序结果和QPCR结果不一致的情况,遇到此类情况,因为这是正常现象(活久见)。
例如:Qpcr:目标基因表达量(循环数)相对看家基因表达量(循环数);RNA-seq:目标基因的表达量(测序reads数),相对样本RNA总表达量(总测序量的reads数),这是最常用的标准。 归一化的原因及处理原则: 1)基因长度 2)测序量 3)样本特异性(例如,细胞mRNA总量,污染等)前两者使用普通的RPKM算法就可以良好解决,关键是第三...
所以通过Excel直接比较不同基因的表达差异时,用TPM可能会更好。而通过DESeq2等软件进行下游分析时,需要提供原始的counts。 04 如何解释qPCR和转录组结果不一致? RNA-seq将mRNA逆转录成DNA,通过高通量测序的方法测定其序列并统计其表达水平。qPCR通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始...