首先通过olig dT磁珠捕获获得含有polyA尾巴的RNA,接着使用olig dT+一段固定序列的引物逆转录合成cDNA第一链,然后把TSO序列通过链置换方式添加到cDNA 3’末端,使用引物PCR扩增形成双链cDNA,最后将双链cDNA末端进行修平和连接ONT测序接头形成测序文库。 图1:NGS全转录组 poly(A) 尾测序方法 技术优势 发现新的转录本...
互作转录组相关研究中,研究物种主要集中于以下几类:致病菌(真菌或细菌)与动植物;共生菌与植物;动物与动物;植物与植物以及病毒与宿主。 建库测序技术 真核宿主-真核病原体:抽提totalRNA,用polyA磁珠富集mRNA,链特异性建库 真核宿主-原核病原体:抽提totalRNA,用去核糖体试剂盒反向富集RNA,dUTP链特异性建库 原核宿主...
RNA-seq最早是利用来源于MicroArray和表达序列标签的方法,对多聚腺嘌呤(polyA)的转录本进行分析。但是,二代测序的应用揭示了这些分析方法的不足,于是新的适用于二代测序的方法应运而生,比如在cDNA合成之前先将RNA碎片化(即打断)可以减少3':5'的偏差;链特异性建库可以用于...
1、使用 oligo dT 针对 RNA 聚合酶 II 转录的 RNA(具有 polyA 结构)进行逆转录(从而避开 rRNA); 2、逆转录到 5 cap 的时候,逆转录酶的末端转移酶活性会不依赖于 RNA 模板, 在 cDNA 的末端加上多个 C(一般是 3 个); 3、然后使用一个带有 GGG 的接头(图中的 TS oligo)与 CCC 进行配对,利用逆转录...
演讲摘要：直接RNA测序是Oxford Nanopore平台独有的测序技术，能够对原始RNA分子进行直接测序。通过一次直接RNA测序实验，我们可以同时获得转录本的全长序列，基因和转录本的表达水平，polyA尾的长度，以及RNA上携带的修饰信息。这次讲座的内容主要包括：直接RNA测序的建库原理和实验方法直接RNA测序的应用案例 余祥 上海交通...
相较于二代测序技术,纳米孔RNA直接测序 (Direct RNA Sequencing, DRS)能够对带有polyA尾的全长mRNA进行直接测序,mRNA穿过纳米孔时产生的电信号差异可用于推断单条mRNA上每个碱基的类别及其修饰信息(图1)。因此,结合机器学习算法,理论上DRS...
其原理和步骤为:首先通过polyA捕获mRNA,或者通过rRNA剔除技术去掉rRNA,然后将获得的RNA打成100nt左右的小片段;之后使用修饰特异性的抗体(m6A或m5C抗体)进行免疫共沉淀,含有修饰的RNA片段被富集并回收;进而对回收的RNA进行文库构建、高通量测序和生物信息学分析,通过peak分析鉴定出RNA修饰的区域。
1、可变 polyA 检测 三代长读长技术的 Iso-Seq 技术,由于利用 OligodT 引物合成 cDNA,poly(A)会出现在测序结果中,并且可以得到从 5’到 3’的完整全长转录本,因此可以直接准确检测到 APA,在分析可变多聚腺苷酸化位点方面具有非常大的优势。 APA 的四种类型 ...
二、转录组测序的主要步骤 RNA提取：从样本（如细胞、组织、血液等）中提取总RNA。常用的RNA提取方法包括TRIzol试剂法、柱式提取法等，需保证RNA的高质量（无降解，完整性好）。mRNA富集或rRNA去除：对于真核生物，通常通过多聚A（polyA）富集策略分离mRNA（大多数真核生物mRNA有polyA尾）。另一种方法是去除rRNA（...
实际上Beads上联接了不同的接头,其中有一个接头包含ploy(dT)序列,在细胞裂解后释放的核酸中,只有mRNA带有polyA tail,于是Beads的poly(dT)接头就可以从众多的裂解产物里捕获到mRNA(实际上drop-seq采用3'端测序,就是为了检测polyA tail)。 Master Mix中带有反转录试剂,当mRNA被捕获后,就可以从它的3‘端开始作为...