RNA提取的一般步骤是:破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA 破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行,可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织,加入β-ME可以抑制RNA酶活性。 分离RNA一半用酚、氯仿等有机溶剂,加入少量异戊醇,经过此步,离心,RNA一般分布于上层,与蛋白层分开。 沉淀RNA一...
对于多数 RT-PCR反应,RNaseH处理是可选的,因为95℃保温的PCR变性步骤一般会将RNA:DNA复合物中的RNA水解掉。
RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中,每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行,然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中,逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下,在一只管中顺次进行。 2.2 RT-PCR的步骤 ⑴在冰浴离心管里面加入模板RNA 4uL,引物2u...
1、在彳N Northern等杂交实验、构建cDNA文库、获取能够编码真核生物蛋白的基因、获彳导RNA病毒基因时,会用到 RNA提取和RT-PCR技术。真核生物的基因组是 DNA,为什么不直接从 DNA PCR得到我们需要的基因呢?因为真核生 物的基因含有大量的非编码区,称为内元(intron),真正编码蛋白的区段是被这些内元隔开的,这些编...
总RNA提取定量与RT-PCR 目的 完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。掌握从细胞中提取总RNA的方法熟悉紫外吸收法检测RNA浓度与纯度的原理及测定方法掌握RT-PCR基因扩增的原理和过程 实验流程 提取 总RNA 定量 合成cDNA 第一链 PCR 电泳...
(完整)总 RNA 的提取定量与 RT-PCR 一、结果 如上图所示。 三、 讨论 (1)特异性反转录 DNA 条带不明显, 且有弥散或非特异性条带,说明 在总RNA 的提取上存在缺陷,导致 RNA 提取量不足且反转录产生其他 DNA 片段。 具体原因可能包括 1) 多种原因导致 RNA 降解或断裂,如操作时间过长,存在污染物,实 验...
毕业设计一直在做这个工作，只不过我提的是植物的。还是DEPC处理过比较放心，虽然比较麻烦。貌似RNA降解的...
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RT-PCR是以提取的RNA为模板,经反转录获得与之互补的DNA(cDNA)序列,再以cDNA序列为模板进行目的片段的扩增。具体过程如图所示。以下有关RT-PCR的叙述正
在对感染西伯利亚百合的CMV,LSV,LmoV3种病毒的检测上,对4种常见的RNA提取方法及影响RT-PCR体系的因素进行了比较研究.改良优化了的RNA提取方法,不需用DEPC水处理和高温烘器皿,省去液氮研磨过程,采用该法从百合叶片中提取总RNA,整个过程及后继反应均不需使用RNasin,降低了成本,同时提取的RNA质量高,适于后期Rrr-PCR的...