RT-PCR灵敏度会受cDNA合成量的影响。RT-PCR产物的大小受限于逆转录酶合成cDNA的能力,尤其是克隆较大的cDNA时。RNaseH-的逆转录酶可以显著提高长RT-PCR产物的产量,同时增加了热稳定性,所以反应可以在高于正常的37-42℃的温度下进行。 2.7RNaseH处理 在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板...
RT-PCR产物的大小受限于逆转录酶合成cDNA的能力,尤其是克隆较大的cDNA时。RNaseH-的逆转录酶可以显著提高长RT-PCR产物的产量,同时增加了热稳定性,所以反应可以在高于正常的 37-42℃的温度下进行。 2.7 RNaseH处理 在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板,据认为cDNA合成反应中的RNA会阻止...
RT-PCR是指将逆转录(Reverse Transcription;RT)反应和PCR (Polymerase Chain Reaction)反应组合在一起的方法。 2.1 RT-PCR的原理 RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起,提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT- PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外,这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建c...
1、在彳N Northern等杂交实验、构建cDNA文库、获取能够编码真核生物蛋白的基因、获彳导RNA病毒基因时,会用到 RNA提取和RT-PCR技术。真核生物的基因组是 DNA,为什么不直接从 DNA PCR得到我们需要的基因呢?因为真核生 物的基因含有大量的非编码区,称为内元(intron),真正编码蛋白的区段是被这些内元隔开的,这些编...
总RNA提取定量与RT-PCR 总RNA提取定量与RT-PCR 目的 完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。掌握从细胞中提取总RNA的方法熟悉紫外吸收法检测RNA浓度与纯度的原理及测定方法掌握RT-PCR基因扩增的原理和过程 实验流程 提取 总RNA 定量 合...
(二)RT—PCR 1. 总RNA的提取:见前述内容。 2. cDNA第一链的合成:目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售,其原理基本相同,但 操作步骤不一。现以TAKARA公司提供的PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试 剂盒为例. (1)在0.2ml微量离心管中,加入以下: 总RNA 1-5 μg 、dNTP 1 μl 、Random ...
毕业设计一直在做这个工作，只不过我提的是植物的。还是DEPC处理过比较放心，虽然比较麻烦。貌似RNA降解的...
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[分析]PCR原理:在解旋酶作用下,打开DNA双链,每条DNA单链作为母链,以4种游离脱氧核苷酸为原料,合成子链,在引物作用下,DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链,即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物,其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链...
在对感染西伯利亚百合的CMV,LSV,LmoV3种病毒的检测上,对4种常见的RNA提取方法及影响RT-PCR体系的因素进行了比较研究.改良优化了的RNA提取方法,不需用DEPC水处理和高温烘器皿,省去液氮研磨过程,采用该法从百合叶片中提取总RNA,整个过程及后继反应均不需使用RNasin,降低了成本,同时提取的RNA质量高,适于后期Rrr-PCR的...