最最最重要的是特异性(即只能扩增需要检测的基因),其他规则(1)引物长度为20- 21 bp;(2) 避免引物中连续出现5个或以上相同碱基,例如AAAAA或GGGGG;(3)每条引物两端的碱基最好是G或C(GC碱基之间为三个氢键连接,保证引物与模板连接的稳固性);(4) GC含量为45%~55%;(5)PCR产物大小为85~300 bp;(6)引物尽...
例如AAAAA或GGGGG;(3)每条引物两端的碱基最好是G或C(GC碱基之间为三个氢键连接,保证引物与模板连接的稳固性);(4) GC含量为45%~55%;(5)PCR产物大小为85~300 bp;(6)引物尽可能的跨内含子-外显子;(7)参考上节引物设计规则;(8)其它。
在反转录前需要对 RNA 进行 DNA 酶消化，避免 DNA 污染影响后续的 qRT-PCR 检测。3、引物和荧光探针设计：对于细胞炎性因子的检测，需要设计特异性的引物和荧光探针，以确保只扩增目标序列并减少假阳性的发生。可以使用在线工具（Primer3 等）设计合适的引物和荧光探针，也可以向商家购买。4、若 SYBR Green 染料法...
② PCR扩增得率低：引物和目的基因序列之间的特异性匹配可能存在问题，导致扩增效率低。可以设计多对引物，从中选择最优的。3、熔解曲线呈现非单一峰 ① 非特异性扩增：当PCR反应条件不够好或引物与非目的基因序列匹配时，可能会导致非特异性扩增产物的形成。这种情况下，熔解曲线可能显示出多个峰。可通过优化PCR反应条...
2.1 qRT-PCR 引物设计原则 2.2 qRT-PCR 引物设计方法 如图所示,我们一般进行定量的方法都是SYBR Green ,里面也可以选择TagMan进行引物设计。 这里介绍的是Beacon Designer 软件设计引物的方法。 根据引物设计原则可以更高GC含量,引物长度,Tm值,产物长度等等。
可以通过 qRT-PCR 的溶解曲线,但是呢,这个还是要耗钱的。对于没有很多钱的实验室来说,在拿到很多引物的时候,可以通过普通的 RT-PCR 看看是否是单一条带,鉴定一下引物的特异性。如果实验室不差钱,则可以通过溶解曲线对所有的引物的特异性做一次鉴定。
1. 上下游引物的长度一般为18-30bp之间,且Tm值在58-62℃之间,上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。 2. GC=30-80%; 3. 应避免引物中多个重复的碱基出现,尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3’端最好不为G或/和C。引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。 4. PCR扩增产物长度:引物的...
qRT-PCR的引物设计需遵循一般PCR引物设计原则并结合额外规则。首选扩增子大小为75-150bp，更长的扩增子（150-200 bp）可验证分析。引物应具有40-60%的GC含量，Tm接近60°C，3'端以2G/C夹紧，避免单核苷酸、二核苷酸或三核苷酸重复，且避免引物的同源和异源二聚化。同时，设计引物时需关注目标上的...
1.将自己的目的基因(cDNA)序列粘贴至https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool 选取最大的一条(出现非特异性扩增的概率低,序列长度长匹配到的基因更稳)将上游引物及下游引物放入NCBI——Blast 目的:是否为非特异性扩增,尤其是基因家族基因相似度高,出现非特异性扩增的可能性更大...
miRNA qRT-PCR试剂盒与引物 基于qPCR 检测技术的miRNA 表达及差异分析是对测序、芯片结果的有效补充与验证,是进一步确定研究对象并做后续功能研究或生物标志物筛选的基础。 锐博生物自主开发了Bulge-Loop™ 和miDETECTA Track™ 以及用于两种不同的 miRNA qPCR检测方法的试剂盒、引物及提供对照,拥有颈环法和加尾法...