最最最重要的是特异性(即只能扩增需要检测的基因),其他规则(1)引物长度为20- 21 bp;(2) 避免引物中连续出现5个或以上相同碱基,例如AAAAA或GGGGG;(3)每条引物两端的碱基最好是G或C(GC碱基之间为三个氢键连接,保证引物与模板连接的稳固性);(4) GC含量为45%~55%;(5)PCR产物大小为85~300 bp;(6)引物尽...
QRTPCR引物设计概述:在QRTPCR过程中,由于涉及到模板定量,所以要求引物特异性强,并且不能扩增出基因组DNA如果用DNA酶处理干净另当别论,所以要求跨外显子设计可以不用考虑基因组DNA污染,或跨内含子设计检验DNA酶是否处理干净,即
1.选择合适的引物长度:引物的长度应该在18-24个碱基对之间,过短的引物可能会导致引物与非特异性DNA结合,而过长的引物则可能会导致非特异性杂交。 2.避免引物的自身互补性:引物的5'端和3'端不应该互补,这会导致引物形成二聚体或发生自身杂交,从而影响PCR反应的特异性和效率。 3.避免引物与非特异性DNA结合:引物...
最最最重要的是特异性(即只能扩增需要检测的基因),其他规则(1)引物长度为20- 21 bp;(2) 避免引物中连续出现5个或以上相同碱基,例如AAAAA或GGGGG;(3)每条引物两端的碱基最好是G或C(GC碱基之间为三个氢键连接,保证引物与模板连接的稳固性);(4) GC含量为45%~55%;(5)PCR产物大小为85~300 bp;(6)引物尽...
4.5.6.7.8.PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150bp最为合适（可以延长至300bp）；要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在；而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效...
根据设计规则，选择基因的前500bp进行定量引物设计。NCBI的primer- BLAST工具可帮助进行设计，输入碱基序列或文件，设定上下游引物起始位置，设定产物长度在85-300bp之间，然后点击“get primers”进行设计。设计完成后，需核对引物特异性，并保存所需的qRT-PCR引物。设计实例为：Forward primer: GAAAACAA...
引物:引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则: ①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。
进入引物条件设定 qRT-PCR染色法——设定参数 填写入CDS序列范围 image.png PCR product长度设定80-200 image.png 返回的引物对数,改成20 Max Tm difference改为2.5 选择必须跨外显子-外显子 image.png 防止残留的基因被引物扩增,对qPCR造成污染 勾选在新页面打开 ...
设计引物时，需遵循特定原则，如利用保守区设计，保持特异性。引物长度在17-25个碱基之间，G+C含量在40%-60%之间，TM值在58-62度之间。避免引物间的二聚体和自二聚体、发卡结构，以保证扩增特异性与效率。通过oligo 7等软件检测引物的二级结构，确保无不良结构。扩增效率检测是确保qRT-PCR结果准确性...