最重要的是,该技术能够对微阵列(microarray)或下一代测序(next generation sequencing, NGS)结果进行额外的独立确认,qRT-PCR的固有优势是动态范围大,灵敏度高,序列特异性强。 (图1 qRT-PCR基本流传和关键概念示意图) 1.2 qRT-PCR引物 qRT-PCR是特殊的PCR和应该报告基因的结合体,所以qRT-PCR的引物设计要满足一般P...
(图1 引物扩增示意图。 PCR基因扩增方向和体内合成方向是一致的,即从5'端到3'端。) 引物设计也应该注重以下规则:引物的结构应相对简单,不含内部二级结构,避免内部折叠;我们还需要避免引物-引物退火,它会产生引物二聚体并破坏扩增过程;在设计时,如果不确定在引物的某个位置放置什么核苷酸,可以在该位置包含多个核苷...
1.将自己的目的基因(cDNA)序列粘贴至https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool 选取最大的一条(出现非特异性扩增的概率低,序列长度长匹配到的基因更稳)将上游引物及下游引物放入NCBI——Blast 目的:是否为非特异性扩增,尤其是基因家族基因相似度高,出现非特异性扩增的可能性更大...
首先获得cDNA序列:打开NCBI中的Gene数据,输入基因名称,点击Search,获得如下图页面,第三个为小鼠的p53基因, 在弹出的页面中找到基因对应的转录本的ID,一般以NM开头为mRNA序列。 点击找到该基因对应的转录本序列 引物设计: 在Primer-blast中输入序列号,然后设置PCR product...
网站上下载得到的文件 打开primer5,file→open→DNA sequence,选择刚刚下载的文件。 选中序列→add→OK 而后就到了下图所示页面,点击Primer 得到如下图,点击search 弹出如下新窗口 根据下图进行选择 点击OK后得到下图 此时即可再根据前述原则来选择自己需要的引物啦~...
引物的设计 在Analyse this sequence列表中找到Pick Primers单击,方法如下,进入引物设计页面。当然也可在NCBI首页的下部找到Primer-BLAST,单击进入相同的页面。 然后将PCR product size 设置为100~200bp,返回的引物数这里保持默认的10对,退火温度保持默认。
qPCR 技术通过引物特异性扩增目标 DNA 序列，并通过荧光探针或 SYBR Green I 荧光染料法检测 PCR 产物的数量，来定量分析样品中目标序列的数量。qPCR 技术具有快速、准确、高灵敏度和高特异性等优点。二、用途 广泛应用于基因表达分析、突变检测、病原体检测等领域。三、材料与仪器 1、试剂：RNA 提取试剂盒、反...
QRTPCR引物设计概述:在QRTPCR过程中,由于涉及到模板定量,所以要求引物特异性强,并且不能扩增出基因组DNA如果用DNA酶处理干净另当别论,所以要求跨外显子设计可以不用考虑基因组DNA污染,或跨内含子设计检验DNA酶是否处理干净,即
qRT-PCR要求对每个样品做三个平行体系。一般来说,每个最终的反应体系为10μl(然而试剂盒上推荐的体系为25 μl,但这样既浪费酶,用中号枪头加样还降低了重复性)。最好用10 μl小号进口枪头加入。 配体系时,一般先将水、MIX及引物混成3倍体积的总体系(此时应给每管留1.5ul的损耗,另外有些仪器还要求加入适量...
② PCR扩增得率低:引物和目的基因序列之间的特异性匹配可能存在问题,导致扩增效率低。可以设计多对引物,从中选择最优的。 3、熔解曲线呈现非单一峰 ① 非特异性扩增:当PCR反应条件不够好或引物与非目的基因序列匹配时,可能会导致非特异性扩增产物的形成。这种情况下,熔解曲线可能显示出多个峰。可通过优化PCR反应...