如我们图中所示的融解曲线的Tm值为87℃。 溶解曲线的作用 融解曲线的Tm值是融解曲线中的重要参数,在使用同一qPCR试剂下,目标基因融解曲线的Tm值是由其产物长度+GC含量决定的。目标基因的qPCR产物长度越长、GC含量越高,Tm值越大。不同的qPCR产物因其长度与GC含量不同,它们的Tm值大小也不一样。 根据此原理,我们...
理想的融解曲线应该只有单一峰型的曲线,如果出现两个以上的峰型,说明出现了引物二聚体或者非特异性扩增的出现: 接下来我们对一些异常的峰型进行分析: 1. 双峰 较低的峰出现在80℃: 问题分析:引物二聚体导致的非特异性扩增; 解决方法:1. 优化PCR反应条件,比如降低引物的浓度等;2. 重新设计引物; 较低峰出现在...
2. 熔解曲线单峰但不尖锐 这可能存在大小相近的非特异性产物,可以利用高分辨率琼脂糖电泳确认。 3.熔解曲线单峰但Tm值在80℃以前 推测未加模板,仅有引物二聚体的扩增。可利用高分辨率琼脂糖电泳确认或重复实验。 4.有扩增曲线无溶解曲线 可能是熔解程序设置错误,未搜集荧光信号,建议重新实验,增加熔解曲线阶段的信号...
(2)同一个基因在不同浓度的相同模板下扩增,其相差的CT值为相差浓度倍数的2次开方。当然这是理论值;另外阴性对照不能有扩增(40个循环以后出CT值属正常现象,也可算作没有扩增)。 2、溶解曲线: (1)溶解曲线是判断扩增产物是否单一的曲线,顾名思义,其跟模板(或其浓度)没有关系,扩增什么基因就应该有其相对应的...
溶解曲线中，Tm值，即熔解温度，反映了目标基因的长度和GC含量。非特异扩增产物的Tm值与目的产物不同，会导致曲线出现双峰或宽峰。若出现杂峰，可能源于引物设计不佳或基因组污染，需重新设计引物或使用基因组清除的试剂盒。总的来说，Qpcr的分析和溶解曲线的解读对于确保实验结果的准确性至关重要。后续...
溶解曲线主峰左侧有峰 一般考虑是引物二聚体或者短的非特异性扩增,解决手段通常有: ◆ 降低引物浓度 20ul体系正常参考引物用量是10uM浓度 0.4ul ◆ 提高退火温度 梯度摸索引物退火温度,一般退火温度不建议超过63°C ◆ 增加模板浓度 当目的基因表达量极低时,染料法QPCR容易形成引物二聚体产物影响实验结果,提高模板...
ct值用平均值,所以最少2个复孔,复孔之间的误差SD值<0.05。复孔之间的Tm值要求相同且单一,表示特异性扩增,结果具有可信度。 扩增曲线,正常的扩增曲线呈S型,同时可以看到复孔之间的重复性好坏。左:log图,右:线性图。 溶解曲线,单一峰,表示特异性扩增且模板无污染。
求助: QPCR溶解曲线分析已有2人参与 实验室小白一枚…最近在做真菌里头一个基因的相对定量分析,做出的qpcr结果很奇怪。目的基因的溶解曲线有两个峰,但这对引物之前师兄师姐一直用都没问题,所以我猜想可能是我的问题…例如基因组DNA没除干净,或是提的RNA有降解导致目的基因出现了不同片段,或是加的引物或模板浓度太高...
不排除极度偶然的情况:1.两个序列的溶解曲线一样 2.没有目标产物,只有一种非特异产物。...阅读全文什么叫QPCR QPCR 问:什么是QPCR?答:QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统,也叫实时定量基因扩增荧光检测系统,简称QPCR。问:QPCR、DNA检测、PCR之间的关系?