引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。 镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix试剂盒。 模板有基因组的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异扩增。 5. 溶解曲线不止一个主峰 引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
qpcr溶解曲线异常(12)发布时间: 2019-11-0314. 标准曲线法相对定量的数据应该怎么处理? 假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化,所用的内对照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的测定结果都是总RNA的pg数,数据的处理方法见下表: 15.什么是CT值比较法?数据怎么处理?
是同样可靠的。内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件最接近一致,缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制,导致它们的PCR效率有差异。外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会,但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大,也会导致它们的PCR效率有差异。
qpcr溶解曲线异常(9)发布时间: 2019-11-03吹打数次。 将废液吸入废液杯中。 重复以上步骤:乙醇三次,去离子水三次。 确认反应孔中的残留液体蒸发完。 8. 什么是背景校正?多长时间执行一次背景校正? 背景校正程序测量定量PCR仪所使用的反应管和水的空白荧光强度。在运行校正程序期间,定量PCR仪在10分钟内连续读取背...
qpcr溶解曲线异常(8)发布时间: 2019-11-035. 应该备份哪些数据? 应该定期备份您的实验数据,备份频率推荐每周一次,用光盘刻录。同时您也应该备份定量PCR仪的各种纯荧光光谱校正文件、背景文件和安装验证实验数据,这些文件所在的目录是C:/Appliedbiosystems/SDS Document。下图是校正文件的样本。 6.怎么样的实验室环境才...
qpcr溶解曲线异常(2) 通常来讲,real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样,要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp 之间,所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法,最好在PCR扩增程序结束后,加一个溶解程序,来形成溶解曲线,判断PCR产物的特异性扩增。而溶解程序,仪器都有默认设置,或稍...
Real-time qPCR数据分析 1. Real-time qPCR常见参数 基线(baseline) 通常是3-15个循环的荧光信号 同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线 阈值(threshold) 自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置:置于指数扩增期,刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。
qpcr溶解曲线异常(4)发布时间: 2019-11-03△Rn:△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果(△Rn=Rn-基线)。 2.影响Ct值的关键因素 模板浓度 模板浓度是决定Ct的最主要因素。控制在一个合适范围内,使Ct在15-35之间。 反应液成分的影响 任何分子的荧光发射都受环境因素影响---比如溶液的pH值和盐浓度。 PCR...