(6)PCR扩增产物长度:引物的产物大小不要太大,一般在80-250bp之间都可;80～150 bp最为合适(可以延长至300 bp)。 (7)引物的退火温度要高,一般要在60度以上; 要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。 而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力,即引物应该跨外显子,最好是引物能跨外显子的
PCR扩增子长度:50-180bp 引物长度:17-25bp GC含量:45-55% Tm:58-68℃,引物对间差异不大于2℃ 碱基随机分布,尽量均匀。3′端要避开AT,GC rich区域,避开T/C或A/G连续结构(2-3个)。引物自身和引物间不能存在互补。引物3′末端为G或C 避免DNA污染,跨外显子接头区 至少设计2-3对引物,预实验筛选最佳引...
太短了特异性不够，扩增效率会比较差，也容易出现非特异性扩增。太长了引物分子不稳定，容易断裂导致扩增...
1、首先打开NCBI，选择“Nucleotide”，并在搜索框输入基因名。一般用目标基因的突变体1去设计引物，也就是要选择目标基因的“transcriptvariant1,mRNA”,没有1就用2、3，以此类推。因为是Q-PCR，所以要去掉内含子，因此用mRNA。2、从上一个页面点击FASTA，可以看到mRNA的序列。3、搜索“NCBIBLAST”并...
Q-PCR干粉引物,..现代科研基本离不开分子实验,分子实验又基本离不开PCR,PCR肯定离不开引物了,今天给小伙伴们讨论收到引物的处理问题。QPCR 干粉引物溶解稀释的一般方法如下:收到引物后,在开启离心管盖前,在3000
PCR产物太长:一般采用80-150bp的产物长度。 3.标准曲线线性关系不佳 加样存在误差:使得标准品不呈梯度。 标准品出现降解:应避免标准品反复冻融,或重新制备并稀释标准品。 引物或探针不佳:重新设计更好的引物和探针。 模板中存在抑制物,或模板浓度过高 4.负对照有信号 引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹...
Q-PCR引物特异性检测方法以96孔板为例 1.将模板DNA,分别稀释50倍,250倍,1250倍,6250倍(5倍稀释) 2.将Q-PCR引物与SYBR GreenI混匀(引物 0.5ul/孔,SYBR5ul/孔) 3.将稀释的模板和引物分别点入96孔板,进行Q-PCR实验 4.在setup里将样品从unknow调成standard 设置平行孔和稀释梯度 5.分析图像结果 (1)看...
(扩增体系在前面讲PCR的学习笔记中也有提到,常用的PCR扩增体系是25 μL、30 μL、50 μL。在用商品化试剂盒做实验的时候,可根据说明书上提供的体系去配制,或者根据这个体系进行优化,得到适合自己实验室环境及条件的扩增体系。不过我们也要明白,这里的扩增体系...
PCR引物设计原则 1、引物长度一般在15-30bp。 引物长度一般为15-30bp,常用的为18-27赵布挥称的除察bp,但不应大于38bp,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应; 2、引物GC含量一般为40%-60%。 引物GC含量一般为40%-60%,以45-55%为宜,GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游...