下拉实验（pull-down assay）是验证体外蛋白互作的主要方式，也是验证没有成熟抗体的蛋白互作的方式之一。通过体外表达亲和蛋白-GST，将亲和蛋白固化在谷胱甘肽亲和树脂上充当“诱饵蛋白”，将细胞或者组织的总蛋白和此“诱导蛋白”混合孵育后可从中捕获“目标蛋白”，最后通过洗脱的方式将“目标蛋白”洗脱后检测，就可以...
实验步骤 1. 蛋白质样品制备 表达融合标签的蛋白质:在适当的宿主细胞中表达融合标签的蛋白质,通过裂解细胞或纯化蛋白质获得蛋白样品。 目标蛋白质:通过表达系统或直接从细胞裂解物中提取,确保蛋白质处于可溶状态。 2. 蛋白质结合 孵育样品:将融合标签的蛋白质样品加入到装有亲和树脂的离心管中,轻轻混合以确保蛋白质...
pull down 实验方法PullDown实验流程 1.混合两种预测相互作用的蛋白。(Protein-A-GST &Protein-B-HIS,下面实验用GST树脂IP,用WesternBlot检测HIS;反之亦然。如果是纯化后的蛋白,需要进行偷袭或者使用超滤离心管为蛋白更换溶液,之后才能继续PullDown。) 2.加入1 mL Binding Buffer。 Binding Buffer:50 mM Tris.HCl...
将洗脱样透析至Buffer(PBS,300mM NaCl, 2mMDTT, pH7.4)中,目的蛋白有沉淀产生,过滤除菌,干冰发货。 三、pull down 实验 1)、分别取200 μl纯化的A-GST与B-HIS至同一1.5 ml EP管中, 另取200 μl 纯化的A-GST与GST蛋白至另一1.5 ml EP管中,4℃旋转孵育2 h以上。 2)、从4℃中取出GST-tag ...
Pull-down实验是一种有效的验证蛋白之间相互作用的体外实验技术,常用来验证酵母双杂交系统或者其他方法筛选到的互作蛋白。 Pull-down实验基本原理是将靶蛋白亲和固定在基质上,充当“诱饵蛋白”,当细胞抽提液或者其他含有目的蛋白溶液过柱时,与靶蛋白相互作用的目标蛋白可以结合到基质上,其他非互作的杂质蛋白则随溶液流出。
步骤详解:RNA pull-down实验这么做,不走弯路! RNA pull-down实验简介,实验原理、流程图、操作方法,常见问题,通通帮你搞定!实验室小白和大神都看过来~ #实验 #科普 #技术 #RNA #青少年课外知识讲堂 - 小金博士于20240329发布在抖音,已经收获了3076个喜欢,来抖音,
GST Pull down实验方法如下: 一、GST-a融合蛋白的表达 1.将目的蛋白与GST的重组质粒转化到BL21菌株中; 2.挑取单克隆到含有5 ml LB培养基(加入5 μl氨苄)的10 ml试管里,37℃恒温振荡培养箱中培养过夜; 3.将培养菌液转移到含有500 ml LB(含500 μl氨苄)的1L锥形瓶中,37℃,200 rpm培养数小时; ...
Pull Down实验是一种验证体外蛋白互作的主要方法,也是验证没有成熟抗体的蛋白互作的方式之一。通过体外表达亲和蛋白-GST,将亲和蛋白固化在谷胱甘肽亲和树脂上充当“诱饵蛋白”,将细胞或者组织的总蛋白和此“诱导蛋白”混合孵育后可从中捕获“目标蛋白”,最后通过洗脱的方式将“目标蛋白”洗脱后检测,就可以分析蛋白和蛋白...
pull down 实验方法PullDown实验流程 1.混合两种预测相互作用的蛋白。(Protein-A-GST &Protein-B-HIS,下面实验用GST树脂IP,用WesternBlot检测HIS;反之亦然。如果是纯化后的蛋白,需要进行偷袭或者使用超滤离心管为蛋白更换溶液,之后才能继续PullDown。) 2.加入1 mL Binding Buffer。 Binding Buffer:50 mM Tris.HCl...
b.Pull-down c.煮样,行Western Blot。 3.通过免疫沉淀蛋白以富集与之相互作用的RNA (1)6盘10cm皿已经长满的细胞。 (2)DEPC处理的PBS洗3遍,10mL/遍。最后用4mL PBS刮下细胞,并将细胞吹散。 (3)将细胞转移至5mL离心管中,2000r/min 离心5min,弃上清。