(1)灭菌双蒸水 (2)DNA:双酶切后的基因片段及线性质粒 (3)T4DNA 连接酶:350U/μL (4)10 连接酶缓冲液:660mmol/L Tris-HCl(pH7.6) 66 mmol/L MgCl2 100 mmol/L DTT 1 mmol/L ATP 2、方法 (1)5mL 离心管中加入以下成分: ddH2O X-DNA pET28a-DNA 10 Buffer T4 ligase (2)14-16℃水浴中...
③通过DNA连接酶将EGFP基因插入到pET28a质粒中,构建原核表达载体pET28aEGFP。 (2)转化与筛选 ①将构建好的原核表达载体pET28aEGFP转化到大肠杆菌DH5α中,涂布在含有Amp的SOC培养基上筛选阳性克隆。 ②通过蓝白筛选法验证阳性克隆是否正确载入pET28aEGFP。
提取基因组 PCR获得 目的片段 构建表达载体 测序验证 电转到宿主菌 优化表达并 纯化可溶性蛋白 EMSA实验 纯化质粒提取质粒 monRII的PCR产物电泳(左) pET28a-monRII酶切电泳(右) 1、表达载体pET28a-monRII构建过程 1:37℃,1.0mmol/L,包涵体;2:37℃,1.0mmol/L,上清;3:37℃,0.8mmol/L,包涵体; 4:37℃,0.8...
内容提示: 原核表达载体 pET28a2EGFP 的构建与表达季爱加, 宁喜斌*( 上海海洋大学 食品学院, 上海 201306)摘 要 以质粒 PEGFP2N3 中增强型绿色荧光蛋白( Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP) 基因片 段为模板, 利用 PCR 技术扩增得到 EGFP 基因片 段, 并设计引 物在其 2 端引 入酶切位点 EcoRⅠ ...
AMP我加100mg/ml能筛选到 但是PEt-28a一直在抗性板上不长 ...那有可能载体不对，或者如果是转化的...
1 可能是太弱你看不出来，建议用His抗体做个western 看看是不是有条带而看不出。2 是不是融解性太差，建议将你的氨基酸序列做个疏水性分析。如果确实如此的话可能要重新构载体
1. 现要求以某一植物或动物组织cDNA为模板扩增A基因,并构建该基因的重组表达质粒pET28aA,并在大肠杆菌BL21中进行表达。[宁波大学2019研]相关知识点: 试题来源: 解析 答案: (1)从组织中提取RNA的步骤如下: ①将组织在液氮中会磨碎,每50~100mg组织加入1ml TRIzol裂解液溶解样品,充分吹打混匀。 ②每1ml TRIzol...
1 可能是太弱你看不出来，建议用His抗体做个western 看看是不是有条带而看不出。2 是江始均施讲不...
1，你的质粒没有完全切开，可能还有完整的空载混在连接产物里面。这和你酶切的效率有关，考虑酶的质量、浓度、和酶切时间。甚至可能是单酶切的结果。2， 切下来的多克隆位点，你没有成功的分离出去，还混在你的连接体系里面，这样的话有一定的概率会重新连接回去。3，你的插入片段加入的不够，要在...
利用组氨酸亲和层析柱纯化TAT-β-Gal融合蛋白,将融合蛋白加入培养的平滑肌细胞.得到高度纯化的,有活性的TAT-β-Gal融合蛋白, TAT-β-Gal在短时间内进入体外培养平滑肌细胞,成功地构建了高表达pET28a-TAT-LacZ重组子,并在体外培养的细胞中证实TAT- β-Gal融合蛋白穿透生物膜的能力,为肽类,生物大分子药物进入组织细胞...