在强磁场作用下,mRNA被分离出来,之后通过洗涤和洗脱可以得到mRNA;当然,也可以通过使用寡聚(dT)引物进行反转录以扩增捕获带有poly(A)的mRNA,但是引物捕获由于特异性差和富集度低,因此在实际操作中还是以磁珠纯化的方法较多。 寡聚(dT...
解析 步骤:1. 提取细胞总RNA;2. 反转录合成cDNA;3. 设计免疫球蛋白特异性引物;4. PCR扩增目标序列;5. 电泳分析产物。实验条件:RNA提取需RNase-free环境;反转录采用逆转录酶和oligo(dT)或随机引物;PCR退火温度根据引物Tm值设定;使用Taq聚合酶和dNTPs;循环数25-35次。 1. **RNA提取**:需用TRIzol法或试剂盒...
图3 应用TaqMan探针的实时定量PCR技术 图3示解析:TaqMan探针具有3个要素:一端的短波长荧光基因(菱形),一段目的DNA特异的碱基序列和另一端的长波长荧光基因(小圆形),探针上的荧光基因十分接近,因此两个荧光基因相互发生淬灭,不产生绿色荧光。探针上的特异的碱基序列被设计成能与目的DNA中部序列结合,在PCR反应中,当T...
通过PCR技术,可以在几小时内从极少量的DNA样本中扩增出足够的DNA量,为各种基因研究和医学诊断提供了快速、敏感和特异的工具。 RT-PCR 逆转录PCR(RT-PCR,reversetranscriptionPCR)是PCR技术的一种变形,常用于基因表达分析、病毒检测、RNA病毒的定量等领域。与传统PCR不同,RT-PCR从mRNA模板开始,通过逆转录酶(reversetr...
实时荧光定量反转录PCR(Real-time RT-PCR,RT-qPCR)是qPCR和RT-PCR的组合,所以RT-qPCR(也有人写成qRT-PCR)是结合了荧光定量技术的反转录PCR,即以mRNA或总RNA为模板,先反转录得到cDNA,再以cDNA为模板,通过荧光定量PCR进行定量检测分析(RT-PCR只可以定性,但不能进行定量分析)。
例如，以基因组DNA为模板时就要选择基因组DNA作为标准品；进行mRNA表达解析时最好选择表达目的基因的Total RNA(或以Total RNA为模板合成的cDNA)作为标准品。即使扩增碱基序列相同，但整体模板不同，也有可能导致PCR扩增效率不同（比如基因组DNA和质粒DNA等）。（1）DNA标准品——通过常规PCR进行目的基因扩增，回收纯化...
解析 先提取RNA,反转录成cDNA,然后根据目的基因设计PCR引物,通过半定量RT-PCR确定目的基因表达. 正因为检测的是mRNA,所以要先反转录成cDNA才能PCR. 分析总结。 先提取rna反转录成cdna然后根据目的基因设计pcr引物通过半定量rtpcr确定目的基因表达结果一 题目 目的mRNA如何检测想看看目的基因转录的mRNA有多少,要做RT-...
解析 答:不可以 【解析】由于PCR是用DNA双链做模板的,所以不能直接用单链RNA做PCR,必须把mRNA逆转录成单链cDNA之后再做PCR。 故答案为:不可以结果一 题目 1.PCR可以扩增mRNA吗? 答案 1.提示不可以,因为PCR是用DNA双链做模板的,不能直接用单链RNA 做PCR,必须把mRNA 逆转录成单链cDNA之后再做PCR。相关...
2.逆转录PCR(RT-PCR):以由mRNA逆转录而来的cDNA为模板,也因为是从表现型基因来进行增量的,由此产生出来的cDNA产物不带有内含子(基因中不具意义的段落),常应用于分子克隆技术。 3.热启动PCR(hotstart PCR):以高热激活型核酸聚合酶进行反应,减少非专一性产物...
MEL (1μM)部分降低了氟氰菊酯诱导的 mRNA 水平。通过实时PCR阵列分析,氟氰菊酯对氧化应激途径基因表达谱的影响显示,在检测的84个基因中,在31个基因中检测到mRNA水平的变化(倍数变化>1.5):13个上调,18个下调。在上调的CYBB、DUOX1、DUOX2、AOX1、BNIP3、HSPA1A、NOS2和NQO1基因上观察到倍数变化>3.0倍。在...