1.样品准备: 提取待检测的蛋白质样品,通常是通过细胞裂解或组织均质化来进行。 2.免疫印迹(Western blot): 使用N-糖基化抗体对蛋白质样本进行免疫印迹分析,以检测和量化N-糖基化修饰。 3.免疫荧光显微镜: 使用标记了荧光的N-糖基化抗体,可以在细胞或组织切片中定位N-糖基化修饰。 4.免疫沉淀(Immunoprecipitatio...
经典的单抗通常由两条重链和两条轻链组成,一般在两条重链的297 位或邻近的谷氨酰胺残基上具有N-糖修饰,通过酰胺键与N-糖的非还原端N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)连接。 两个N-乙酰葡萄糖胺和3 个甘露糖(Man)组成N-糖的核心五糖结构,其还原端若再加和两个N-乙酰葡萄糖胺则为G0;G0 基础上非还原端加和一个半...
罗氏的PD-L1抗体药物采用最直接的办法,突变掉298位的N-糖基化位点,仍采用动物细胞表达。 二、韩美LAPS技术平台 韩美的LAPS技术平台,应用于多肽(胰岛素、GLP-1等),其中糖尿病药物于2015年以44亿美元的天价卖给赛诺菲。LAPS基于Fc的长效机制,通过化学偶联而非融合表达。Fc段采用大肠杆菌表达,体外用化学方法与目的蛋白...
对糖基化修饰进行表征的主要方式之一是液相色谱串联质谱技术,但该方法目前主要集中在中高丰度的聚糖表征,对低丰度的糖基化修饰研究较少。本研究建立了基于RapiFluor-MS试剂标记的单克隆抗体药物的N-聚糖定性和定量分析技术,该方法样品处理时间短,灵敏度高,不仅能够表征3种单抗药阿达木单抗、贝伐珠单抗和曲妥珠单抗的主...
N-糖基化抗体也可以用于免疫沉淀实验,以富集特定的N-糖基化蛋白质,便于进一步的质谱分析。 5.质谱分析: 质谱分析可以用于精确地确定N-糖基化修饰的位置和程度。 以上就是使用N-糖基化修饰检测用抗体的一般步骤。这些抗体为我们提供了强大的工具,帮助我们更好地理解N-糖基化在生物过程中的角色。发布...
到目前为此,重链上高水平无糖基化修饰的抗体(highlevels of nonglycosylated heavy chain,NGHC)中还没有发现其具有免疫原性,同样也就不具有生物活性。NGHC型抗体完全失去了FcγRIII的结合能力,与C1q的结合能力也降低了10倍,从而导致该类型抗体失去了ADCC和CDC活性。此外,Ha等对比了半糖基化单抗(一条糖链)与完全糖...
研究抗体药物的糖基化修饰为何重要?(6) 与唾液酸类似,人类细胞单一的表达β-1,4-半乳糖,而其他哺乳动物细胞还表达对人类具有免疫原性的α-1,3-半乳糖,这种α-1,3-半乳糖修饰为人类异种移植猪器官带来了阻碍。同时,鼠科细胞第NS0和Sp2/0生产的抗体中也可能会有这种半乳糖修饰,这类抗体在使用时应严加控制,...
抗体的关键质量属性(CQAs)是评判其是否合格的标准,CQAs必须是在一个合适的范围内,以保证药物的有效性,更重要的是药物的安全性。通过影响Fc端的效应功能,Fc端的糖基化修饰会对抗体的安全性造成影响,其表现形式为免疫原性、PK/PD(药物代谢动力学/药物效应动力学)等。
很多研究中均有报道,唾液酸糖基化修饰会影响抗体与FcγRIIa的结合,从而降低抗体ADCC活性。 抗体的糖基化修饰中,岩藻糖被认为是影响ADCC活性最重要的单糖,去岩藻糖化可以显著提高抗体与FcγRIIIa的亲和力及ADCC活性(最高达100倍),目前的研究还没有发现岩藻糖化对CDC活性的影响。如图3,Tsuguo Kubota团队通过基因...
【干货分享】四大类糖基化修饰(3) ③ 杂合型,包含①和②的特征。主要代表糖型可见如下图谱展示: 以其中一种糖型为例:天线末端和糖型骨架分别如下: 3、色氨酸残基上的C-糖基化(C-linked)。此类糖基化较为罕见,目前仅在为数不多的天然产物中发现。此过程是通过C-C 键将甘露呋喃糖基连接到色氨酸吲哚环的...