随后一步的超滤换液可通过切向流过滤(TFF)实现,去除包封过程的有机溶剂等物质,同时对LNP-mRNA进行浓缩,并置换到特定处方缓冲液中,稳定储存。 这一单元的相关参数包含处方组成和工艺参数。处方组成包括缓冲液的组分、pH、保护剂成分和浓度等。TFF工艺参数包括切向流速、跨膜压(TMP)、滤液通量、剪切力等。 2.4 除菌...
随后一步的超滤换液可通过切向流过滤(TFF)实现,去除包封过程的有机溶剂等物质,同时对LNP-mRNA进行浓缩,并置换到特定处方缓冲液中,稳定储存。 这一单元的相关参数包含处方组成和工艺参数。处方组成包括缓冲液的组分、pH、保护剂成分和浓度等。TFF工艺参数包括切向流速、跨膜压(TMP)、滤液通量、剪切力等。 2.4 除菌...
mRNA-LNP包封制备是mRNA制剂制备的关键工艺,除了脂质成分配方外,就是工艺过程的控制了,即如何控制mRNA与脂质成分的接触和相互作用过程,通过微流控技术以形成稳定、均一、收率高的mRNA-LNP复合物。mRNA-LNP溶液通过100kD/300kD TFF技术进行浓缩换液,mRNA-LNP复合物被截留,乙醇、制剂被洗滤。最后除菌过滤采用0.22μm...
这使得硫酸铵沉淀法在纯化IVT体系或后续下游工艺中的mRNA方面，表现出了接近Oligo dT亲和层析的水平，并且其操作简便，无需特殊设备，成为了一种理想的选择。对于残留量较高的T7聚合酶，我们探索了一种新的处理方法：通过蛋白酶K消化后，再利用TFF膜过滤技术进行去除。这种技术已经成功应用于BioNtech的COVID-19 mRNA...
作为替代，可改用切向流过滤(TFF)和色谱技术高效去除杂质。下一步是体外转录，即以线性化pDNA为模板转录合成mRNA。 这一酶促反应采用天然转录工具，包括RNA聚合酶和核苷三磷酸。转录后，未成熟mRNA需要在5’端加上帽子，加强其在细胞中的稳定性和转导效率。加帽有共转录和酶法两种方式。共转录加帽通常将帽类似物...
为此,提出了无RNAse的纯化方法,使用氯化钙沉淀,然后进行切向流过滤(TFF),分别去除高分子量 RNA 和低分子量 RNA。这两个步骤也有助于减少微生物蛋白质和宿主DNA,并且可以浓缩产物。此外,在色谱分析之前进行浓缩可以减少柱上样时间,从而加速整个过程。 纯化过程中,基于不同原理的层析步骤可分离不含宿主DNA、RNA、蛋白...
TFF技术在mRNA药物制备中的应用 1.mRNA生产工艺步骤 mRNA的生产工艺步骤基本上分为以上三个步骤,质粒DNA原液制备的基础是转录模板的序列设计,制备方法通常采用质粒DNA扩增,也可采用PCR扩增。以DNA扩增为例,通常采用工程菌E.coli发酵来扩增。先进行菌种复苏,质粒DNA的生产经过发酵培养、收获澄清、精制纯化、线性化、分装...
首先,使用TFF装置对样品进行纯化、浓缩及缓冲液置换。接下来,使用层析填料进一步纯化。以Oligo dT柱层析为例,赛默飞生物工艺的POROS Oligo (dT)25由脱氧胸腺嘧啶(dT-25) 配体组成,通过特有的linker连接到50μm POROS基质上,dT-25配体通过 AT 碱基配对与带有polyA 的 mRNA ...
同样,离子交换层析、亲和层析和离子对反相层析促进高效的大规模 RNA 纯化并提高产量。切向流过滤 (TFF) 有助于去除较小的污染物并浓缩 DS,以及沉淀反应,促进 mRNA 的快速纯化。尽管如此,DSP 的成本和效率在很大程度上取决于各个制造商设计的特定产品纯化工艺。
mRNA的下游工艺包括切向流过滤(TFF)、层析以及随后的第二次切向流过滤。第一个TFF步骤参考了专利[WO2014140211A1],其使用TFF装置,在单个1小时的步骤中,对料液进行纯化、浓缩和缓冲液置换,其顺序与小规模生产中的步骤一致。作者采用改性聚醚砜膜,并建议其截留分子量 (MWCO) 不超过产物分子量的2/3。对于长度为2000...