为了保证反应液配制的准确性,减少分装造成的误差,应按照比实际用量稍大的体积配制反应液,最后加入RNA样品。 注意:注意反转录步骤RNA投入量按等体积进行,后续实验稀释及上机检测皆按比例进行。 2. 按如下程序进行反转录: 37℃,15min;85℃,5sec;-20℃保存备用! 3.定量PCR检测 1) 将Mix在4℃下融解,轻柔地上下...
🔟 干燥与溶解:室温晾干后,加入适量DEPC水(推荐20ul)溶解。测量浓度,进行后续RT-PCR。 1️⃣1️⃣ RT-PCR:逆转录时,逆转的量与Input相同。 1️⃣2️⃣ 结果分析:计算Δct=CT RIP-CT Input,表达量=2^(-Δct)。 通过这些步骤,你可以深入探索RNA修饰的奥秘。🔎📚 0 8 发表评论 发表 ...
前两个环节谈到过,IP是用该修饰的特异性抗体,通过免疫共沉淀富集带修饰的片段,Input是不进行富集的所有片段,这两个是MeRIP-qPCR必做的,每个样品分别做了这两部分的PCR结果合起来计算才能体现修饰水平,达到实验的目的。而IgG是用非特异性抗体,通过免疫共沉淀富集非特异性结合的片段,可作为对IP的对照,证明IP的信号不...
- 使用protein A/G磁珠结合抗体，通过磁力架分离沉淀物，重复洗涤3次以去除未结合的抗体和杂质。RNA纯化回收步骤：- 加入Trizol裂解液，裂解后按照之前步骤纯化回收RNA。完成RNA提取、片段化和免疫沉淀后，进行RNA反转录。按照实际用量配制反应液，确保准确性，然后按照特定程序进行反转录。定量PCR检测作为实...
MeRIP实验步骤: 提取总RNA:首先提取细胞中的总RNA。 抗体拉RNA:用修饰抗体拉取特定RNA。 清洗Beads:用NT2 buffer清洗beads,并进行后续操作。 提取RNA:提取beads上的RNA,并进行测序或qRT-PCR验证。这两种实验方法都需要在低温条件下进行,并添加RNase Inhibitor和蛋白酶抑制剂,以确保实验结果的准确性。0...
一、常规PCR PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,其中引物的好坏与PCR结果有密切关系。PCR不仅要求引物与靶DNA特异结合,还要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸(图1)。 图1 PCR实验原理 ◆ 引物设计要遵循以下原则 ◆ 01.引物长度一般在15-30bp; 02.引物GC含量一般为40%-60%; 03.引物所对...
2. RNA提取的质量和纯度对于后续的实验步骤非常重要,因此需要使用高质量的RNA提取试剂盒,并严格按照试剂盒的说明书进行操作。 3.在进行RNA免疫沉淀和免疫复合物捕获时,需要使用特异性抗体,并确保抗体的质量和纯度。 4.在进行PCR扩增时,需要使用适当的引物,并确保引物的特异性和有效性。 5.在进行测序时,需要使用高...
PCR 反应需要引物跟目标序列区域进行 充分碰撞,那么如果只使用 mRNA 会大大降低一次 PCR 反应的起始 量。通过计算我们认为 5-10ng 做 1 次 PCR 反应较为合理。也就是 1 个样本中验证 1 个基因不做生物学重复只做 3 个复孔需要至少 15ng 的 mRNA 或 300ng 的 total RNA。那么 3 个生物学重复就需要 ...
根据ALKBH5敲低或对照HaCaT细胞的RNA-seq分析,IGV追踪PELI2表达。实验设置两个重复。 WB敲低ALKBH5后,检测HaCaT细胞PELI2蛋白表达。 通过IF染色分析PWD8中的WT和ALKBH5-/-小鼠创缘皮肤PELI2表达。虚线表示表皮边界。比例尺:100 μm。 qRT-PCR显示PELI2在WT和ALKBH5-/-小鼠原代角质形成细胞中的mRNA表达。实验重...
三种技术的对比分析表明，它们各自适用于不同的研究场景，具有一定的优势和局限性。选择合适的技术取决于研究问题的具体需求和样本类型。案例分享：环状RNA（circRNA）是一类新型非编码RNA，在癌症的发生发展中起重要作用。本研究通过RNA测序、qRT-PCR、体外和体内实验，以及RNA pull-down、质谱分析、双荧光素...