对于一些珍稀及RNA含量较低的样本,MeRIP-seq遥不可及。 2018年,多伦多大学何厚胜课题组推出了微量RNA的MeRIP-seq技术,该技术从RNA的起始量、RNA片段化的条件、清洗/洗脱条件等角度优化了MeRIP-seq实验流程,使得MeRIP-seq所需肿瘤的总RNA最低降至2µg,打破了传统protocol的限制(Zeng et al 2018),主要流程如下(...
根据各组样品的基因的read count,可采用目前使用最广的差异基因分析软件进行差异基因分析,有生物学重复分析软件为DESeq2[18],无生物学重复分析软件为edger。 (九)差异表达基因富集分析 利用clusterprofiler对差异表达mRNA、差异表达cicrRNA的源基因、差异表达lncRNA的靶基因分别进行GO和KEGG富集分析并作图。 (十)差异m6...
图2:m⁶A与生物学功能 早期的实验方法已经在rRNA和mRNA中鉴定到m6A的存在,但由于实验技术的限制,对m6A的研究一直没有大的进展。近年来,RNA去甲基化酶FTO的报道,使得对m6A修饰的研究再次进入人们的视野。随后,MeRIP-seq/m6A-seq实验方法的建立使得...
根据各组样品的基因的read count,可采用目前使用最广的差异基因分析软件进行差异基因分析,有生物学重复分析软件为DESeq2[18],无生物学重复分析软件为edger。 (九)差异表达基因富集分析 利用clusterprofiler对差异表达mRNA、差异表达cicrRNA的源基因、差异表达lncRNA的靶基因分别进行GO和KEGG富集分析并作图。 (十)差异m6...
MeRIP-seq将RNA上发生m6A修饰的区域富集后进行测序,因此发生m6A修饰的区域,IP文库所覆盖的reads数会显著高于input文库,从而形成“峰(peak)”。检测这些峰的位置即可得到RNA上发生m6A修饰的位置。 鉴定得到m6A修饰后,再对m6A修饰进行注释、分布统计、motif鉴定等分析。
用SMARTer® Stranded Total RNA-seq Kit v2 - Pico Input Mammalian User Manual根据说明书对IP与Input样品进行反转录及文库构建;利用AMPure XP bead进行片段大小选择,获得最终文库。 构建原理图如下: 图3:富集流程示意图 (三)文库质检 文库构建完成后,先使用Qubit2.0进行初步定量,稀释文库至1ng/ul,随后使用Agile...
4.2 微量MeRIP-seq 在2013年首次发表的MeRIP-seq protocol中,需要300µg的RNA才能开展实验(Dominissini et al 2013),这样的RNA起始量极大的限制了该技术的应用。对于一些珍稀及RNA含量较低的样本,MeRIP-seq遥不可及。 2018年,多伦多大学何厚胜课题组推出了微量RNA的MeRIP-seq技术,该技术从RNA的起始量、RNA片段...
1.ZengY,WangS,GaoS,SoaresF,Ahmed M,GuoH,etal.(2018) Refined RIP-seq protocol for epitranscriptome analysis with low input materials.PLoSBiol16(9):e2006092. 2.Batista PJ. The RNA Modification N(6)-methyladenosine and Its Implications in Human...
(2)鉴定(1)中得到的基因与差异表达基因之间的重叠关系。 (3)利用四象限图展示。 (十一)信息分析流程示意图 图9:分析流程示意图 四、总结:甲基化RNA免疫共沉淀(MeRIP-seq/m6A-seq)研究思路 MeRIP通过m6A特异性抗体富集和测序,用于研究RNA的腺苷甲基化修饰。易基因自主研发微量RNA甲基化检测技术,样本起始量可降低...
一些改进方法(比如miCLIP-seq)通过将m6A抗体和其结合的RNA交联,从而在修饰位点附近诱导序列突变或发生截断,可实现近乎单碱基分辨率的检测水平[12, 14]。然而,这些突变或截断类型十分复杂,不同位点之间差异很大,常分散在3~4碱基的序列窗口内[12, 14]。 Arraystar解决方案:对经MazF酶处理的,因具有m6ACA序列而未被...