对于一些珍稀及RNA含量较低的样本,MeRIP-seq遥不可及。 2018年,多伦多大学何厚胜课题组推出了微量RNA的MeRIP-seq技术,该技术从RNA的起始量、RNA片段化的条件、清洗/洗脱条件等角度优化了MeRIP-seq实验流程,使得MeRIP-seq所需肿瘤的总RNA最低降至2µg,打破了传统protocol的限制(Zeng et al 2018),主要流程如下(...
单细胞转录组测序(scRNA-seq)发现sp8阳性的神经元中YTHDF1的表达下降在中间神经元中最为明显,而这部分神经元,后续会发育成VIP中间神经元。YTHDF1的功能主要是识别RNA上的甲基化位点。通过RIP实验(RNA结合蛋白免疫沉淀)和m6A-seq测序分析发现m6A被高度富集在突触素(Synaptophysin)的mRNA上,同时Synaptophysin的mRNA上有Y...
我们提出了一种定量的m6A-SAC-seq方法,可在单碱基分辨率下绘制整个转录组中的m6A位点。该方法只需要~30ng的输入RNA (来自300ng的总RNA),因此适用于研究各种生物系统。我们以单碱基精度和化学计量信息绘制了详细的m6A综合图。m6A-SAC-se...
m6A抗体富集这部分的protocol,请参考m6A权威,m6A-seq的发明人以色列特拉维夫大学医学院的Gideon Rechavi教授发表在Nature Protocols(Pubmed id:23288318)的文章。这里面会有非常详细的步骤教你如何做m6A抗体去IP带有甲基化修饰的RNA。到时候注意打断长度为200-300nt即可,打断需要做几次条件实验。也就是说除了打断长度转换...
用SMARTer® Stranded Total RNA-seq Kit v2 - Pico Input Mammalian User Manual根据说明书对IP与Input样品进行反转录及文库构建;利用AMPure XP bead进行片段大小选择,获得最终文库。 构建原理图如下: 图3:富集流程示意图 (三)文库质检 文库构建完成后,先使用Qubit2.0进行初步定量,稀释文库至1ng/ul,随后使用Agile...
4.2 微量MeRIP-seq 在2013年首次发表的MeRIP-seq protocol中,需要300µg的RNA才能开展实验(Dominissini et al 2013),这样的RNA起始量极大的限制了该技术的应用。对于一些珍稀及RNA含量较低的样本,MeRIP-seq遥不可及。 2018年,多伦多大学何厚胜课题组推出了微量RNA的MeRIP-seq技术,该技术从RNA的起始量、RNA片段...
二、甲基化RNA免疫共沉淀(MeRIP-seq/m6A-seq)实验流程 从样品处理到最终数据获得中每一个环节都会对数据质量和数量产生影响,而数据质量又会直接影响后续信息分析的结果。为了从源头上保证测序数据的准确性、可靠性,需对样品处理、建库、测序每一个生成步骤都严格把控,从根本上保证了高质量数据的产出。流程图如下: ...
MeRIP-seq将RNA上发生m6A修饰的区域富集后进行测序,因此发生m6A修饰的区域,IP文库所覆盖的reads数会显著高于input文库,从而形成“峰(peak)”。检测这些峰的位置即可得到RNA上发生m6A修饰的位置。 鉴定得到m6A修饰后,再对m6A修饰进行注释、分布统计、motif鉴定等分析。
m6A抗体富集这部分的protocol,请参考m6A权威,m6A-seq的发明人以色列特拉维夫大学医学院的Gideon Rechavi教授发表在Nature Protocols(Pubmed id:23288318)的文章。这里面会有非常详细的步骤教你如何做m6A抗体去IP带有甲基化修饰的RNA。到时候注意打断长度为200-300nt即可,打断需要做几次条件实验。也就是说除了打断长度转换...
图2:m⁶A与生物学功能 早期的实验方法已经在rRNA和mRNA中鉴定到m6A的存在,但由于实验技术的限制,对m6A的研究一直没有大的进展。近年来,RNA去甲基化酶FTO的报道,使得对m6A修饰的研究再次进入人们的视野。随后,MeRIP-seq/m6A-seq实验方法的建立使得...