MeRIP-qPCR 是m6A-IP-qPCR 的另一种说法。所以从名称上我们就能发现,m6A-IP-qPCR基本和常规的RIP-qPCR相似。当然在讨论RIP-qPCR之前,我们先来看看常规的RT-qPCR 是如何计算相对表达量的。 关于RT-qPCR的方法学论文很多,所以这里关于实验部分就不细讲了。计算基因的绝对定量需要加入外参基因,所以暂且我们先来看看相...
1)MeRIP-qPCR的目的 与普通的qPCR有所不同,MeRIP-qPCR是验证某个目标基因上的某个修饰位点(以一小段区域的形式,MeRIP法精确不到单碱基)的修饰水平。得到的结果往往是一个%(IP/Input)的数值,它体现的是该位点的修饰水平(目标基因发生该修饰的转录本占该基因总转录本的比例),而普通qPCR验证的是某个基因的表达水...
通过体外和体内挽救实验(In vitro and in vivo rescue experiments)验证下游靶标对ALKBH5缺失细胞或动物的功能表型作用。此外,通过RIP-qPCR、RNA下拉和RNA稳定性分析揭示了互作的reader蛋白和调控机制。 研究结果表明,ALKBH5在创缘表皮中特异性上调。ALKBH5敲除抑制了ALKBH5-/-小鼠的角质形成细胞(keratinocytes)迁移,并...
技术原理:RIP(RNA结合蛋白免疫沉淀)是研究细胞内蛋白与RNA结合情况的技术。运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析,结合的RNA可以通过高通量测序(RIP-seq)或定量PCR(RIP-qPCR)方法来鉴定。RI...
技术平台:m6A-seq(MeRIP-seq)、RNA-seq、m6A-RIP-qPCR 、qRT-PCR、Dot-blot、WB/IF等 研究摘要: 创面再上皮化受损会导致皮肤屏障重建功能障碍。m6A RNA修饰参与RNA命运决定,m6A甲基化变异会触发许多疾病发病机制。然而,m6A在创面再上皮化中的作用仍然未知。本研究构建ALKBH5-/-小鼠以研究ALKBH5敲除后创面再上皮...
m6A-RIP和qPCR的联合使用证实OGDH mRNA发生m6A修饰,而且当ALKBH5缺乏时或者在病毒感染期间,OGDH mRNA上的m6A水平会进一步升高。野生型ALKBH5而不是H205A或R107Q突变体的过表达拯救了缺乏ALKBH5的巨噬细胞中的OGDH表达。因病毒感染而受到损...
技术平台:m6A-seq(MeRIP-seq)、RNA-seq、m6A-RIP-qPCR 、qRT-PCR、Dot-blot、WB/IF等 研究摘要: 创面再上皮化受损会导致皮肤屏障重建功能障碍。m6A RNA修饰参与RNA命运决定,m6A甲基化变异会触发许多疾病发病机制。然而,m6A在创面再上皮化中的作用仍然未知。本研究构建ALKBH5-/-小鼠以研究ALKBH5敲除后创面再上皮...
RIP-qPCR结果证实Hspa1a mRNA能直接与METTL3蛋白结合(图4f)。MeRIP-qPCR验证了在METTL3沉默的细胞系中Hspa1a mRNA的m6A修饰水平显著降低(图4g)。随后进行RNA稳定性实验以分析METTL3介导的m6A修饰对Hspa1a表达调控作用机制。METTL3沉默后,Hspa1a mRNA的衰减速度显著快于对照组(图4h)。这些结果表明METTL3增加了Hspa1a...
Readers的RIP-qPCR验证Readers蛋白与靶基因mRNA的结合 关于易基因RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术 易基因MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段(包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA),结合高通量测序,可以对RNA上的m6A修饰进行定位与定量,总RNA起始量可降低至10μg,最低仅需1μg总RNA。广泛应用...