所以这就是测序不需要IgG文库，而我们做m6A-IP-qPCR 需要IgG富集的原因。搞定了样本起始量和IgG的问题后，我们具体来看下步骤：第一步，先对RNA进行特异性富集和打断。即在打断之前，我们需要搞清楚研究对象只是mRNA还是lncRNA。若只研究mRNA 可以先用oligodT磁珠进行富集后再进行打断。如果是lncRNA和mRNA都要
第六步,进入常规的qPCR的步骤。 当然这里需要注意的是,这类实验仅仅是对发生RNA甲基化的基因进行相对定量检测,甲基化程度高应该还要和基因本身的转录水平相结合。MeRIP-qPCR还需要结合其他实验,如常规的qPCR、WB等才能从多个角度来验证,最终得到想要的结果。
构建原理图如下: 图3:富集流程示意图 (三)文库质检 文库构建完成后,先使用Qubit2.0进行初步定量,稀释文库至1ng/ul,随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测,insert size符合预期后,使用qPCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度> 2nM),以保证文库质量。 (四)上机测序 文库检测合格后,把不同文库...
今天我们会来带领⼤家如何⼀步步开展⾃⼰的实验，⾝临其境地去体验m6A实验的每个阶段所要完成的步骤。这篇⽂章会⽐较“啰嗦”和冗余，⽬的在于帮助刚踏⼊科研的同学们快速梳理⾃⼰的思路。如果⽼师有新的见解，也欢迎提出⾃⼰的想法与意见。阶段⼀：了解什么是RNA甲基化 例如⼩陈是基础...
图2. m6A信号区可视化 ( m6A甲基化测序结果中的wig文件能够上传到基因组浏览器中,以便进行m6A信号区域的可视化。) 图3. MeRIP-qPCR检测各组细胞中ANPG m6A修饰水平差异。 图4. Dot Blot检测各组细胞中总m6A修饰水平,以亚甲基蓝染色作为RNA上样量内参。
图8 MeRIP-qRT-PCR技术流程 1.2.2、SELECT 基于单碱基延伸和连接的qPCR扩增方法(SELECT)利用m6A阻碍DNA聚合酶和连接酶的事实,方便快速地检测m6A修饰及其在特定位点的程度(Xiao等人,2018)。SELECT使用DNA聚合酶和连接酶连接靶位点的两个互补DNA引物。在这个过程中,m6A首先干扰上游引物的延伸,然后阻碍下游引物的连接。尽...
MeRIP-qRT-PCR已被广泛用于验证高通量测序鉴定的m6A peaks。mRNA或总RNA被片段化为100-200nt,随后用m6A抗体进行免疫沉淀,富集的RNA通过常规qRT-PCR进行定量(图2)。尽管MeRIP-qRT-PCR简单实用,但它不能提供单碱基分辨率,并且依赖于m6A抗体的特异性。 基于单碱基延伸和连接的qPCR扩增方法(SELECT)利用m6A抑制DNA聚合酶...
Ø 微量MeRIP-seq:优化MeRIP-seq的RNA扩增建库步骤,能够适用更低起始量材料。采用去rRNA方法建库,能够检测mRNA和非编码RNA的m6A修饰。 Ø miCLIP-seq:基于紫外交联和IP技术,实现单碱基分辨率检测,利用C-T突变来准确识别m6A修饰位点,可以在同一个峰内检测多个m6A位点。 Ø MAZTER-seq:基于MazF酶切富集ACA序列,...
验证结果可借助MeRIP-qPCR等方法。研究m6A时，通常从预实验、差异基因挖掘到功能验证的步骤进行。与其它m6A检测方法相比，MeRIP-seq的优势在于全基因组检测、基因级别的精确度、组间对比的可行性，以及与多组学数据的联合分析能力，使得其在科学研究中具有高度的实用性和通用性。