该试剂盒利用选择性渗透程序去除胞浆前LC3和LC3-I,并保留自噬体膜结合的LC3-II(图1)。在固定和透化后,用抗LC3抗体探测含有LC3-II的细胞,然后用HRP缀合的第二抗体探测。每个试剂盒提供足够的试剂来进行多达48次测定。 图1:LC3的处理。在自噬过程中,前-LC3经历C末端蛋白水解形成LC3-I(胞浆)。LC3-I蛋白与磷...
因此在进行半定量检测时,除了使用比值外,还可以考虑使用LC3-II与管家蛋白的比值进行辅助判断;其次,由于LC3-II和LC3-I的分子量相近且电泳迁移率差异不大,因此在进行Western Blot时需要使用高浓度分离胶和适当的转膜条件以确保准确分离和检测;最后,由于抗体对LC3-II的亲和性可能更高,因此LC3-II条带显...
1.抗LC3抗体涂层板(零件号51161B):一个96孔板条板(8 x 12)。 2.100X细胞溶质LC3去除试剂(零件号51151A):一支1mL试管 3.抗LC3抗体(零件号51162C):一管50L的抗LC3抗体。 4.二级抗体,HRP结合物(1000X)(零件号230003):一个20L小瓶。 5.分析稀释剂(零件号310804):一个50毫升的瓶子。 6.10倍洗涤缓冲液(...
目前的LC3抗体所检测的抗原表位都位于LC3的N端,由于PE基团结合可能导致N端区域的构象变化,使得抗体对LC3-II的亲和性更高,所以LC3-II条带显色深并不能代表该样本处于高自噬状态。 在半定量时,除了使用LC3-II/LC3-I的比值外,也有科学家使用LC3-II与管家蛋白(Housekeeping Protein)的比值进行半定量。 图5 CST LC3...
目前的 LC3 抗体所检测的抗原表位都位于 LC3 的 N 端,由于 PE 基团结合可能导致 N 端区域的构象变化,使得抗体对 LC3-II 的亲和性更高,所以 LC3-II 条带显色深并不能代表该样本处于高自噬状态。另外,LC3-I 对反复冻融更为敏感,也更易在 SDS 上样缓冲液中降解。基于以上两个原因,在半定量时,除了使用 ...
1.抗LC3抗体涂层板(零件号51161B):一个96孔板条板(8 x 12)。 2.100X细胞溶质LC3去除试剂(零件号51151A):一支1mL试管 3.抗LC3抗体(零件号51162C):一管50µL的抗LC3抗体。 4.二级抗体,HRP结合物(1000X)(零件号230003):一个20µL小瓶。
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这时隔壁热心的师兄告诉小优,想要观察自噬有没有参与,最简单的就是做下LC3的WB。WB这个小优可擅长了,三下五除二,就借(骗)到了隔壁实验室的LC3抗体。 还是先查查LC3再做吧,LC3是一种蛋白轻链3,是自噬过程的标志物。它的功能主要参与了自噬小体的形成, LC3前体分子被ATG4B剪去C端的5肽,裂解形成胞质形式LC3-I...
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被人微管相关蛋白轻链3II(LC3II)捕获抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人微管相关蛋白轻链3II...
目前的LC3抗体所检测的抗原表位都位于LC3的N端,由于PE基团结合导致N端区域的构象变化,使得抗体对LC3-II的亲和性更高,LC3-II/ LC3-I的比值存在较大的误差。LC3-II条带显色深并不能代表该样本处于高自噬状态,因此也有人用LC3-II与内参的比值进行半定量的方式进行评估。 另外,LC3-I对反复冻融更为敏感,因此...