一般来说,抗LC3抗体的灵敏度明显高于LC3-I,尤其是那些针对N端的抗体。 抑制剂使用:为了更准确地判断自噬状态,可以在实验中加入溶酶体蛋白酶抑制剂(如氯喹、巴佛洛霉素A1等),以抑制LC3-II的降解。 数据分析:在数据分析时,除了使用LC3-II/LC3-I的比值外,还可以结合其他自噬相关蛋白(如p62)的表达情况来综合评估自...
抗体选择:目前大部分LC3抗体选择的抗原位于N端,PE基团的加入可能会使得N端蛋白构象变化,导致抗体对LC3的亲和力增强,所以LC3-II条带深并不能代表该样本处于高自噬状态。 冻融敏感性:LC3-II对冻融比较敏感,容易在SDS上样缓冲液降解。因此,在做半定量检测时,除了使用LC3-II/LC3-I的比值外,也可以配合使用LC3-II与...
部分细胞本身LC3-I的基础水平就很低, LC3-I本身就很容易降解,也更易在SDS上样缓冲液中降解, 对反复冻融更为敏感。 目前的LC3抗体所检测的抗原表位都位于LC3的N端,由于PE基团结合可能导致N端区域的构象变化,使得抗体对LC3-II的亲和性更高,所以LC3-II条带显色深并不能代表该样本处于高自噬状态。 在半定量时...
翻到其中一页,给我讲到:目前的LC3抗体所检测的抗原表位都位于LC3的N端,由于PE基团结合可能导致N端区域的构象变化,使得抗体对LC3-II的亲和性更高。以CST抗体为例,LC3B的货号有单克隆抗体# 3868和多克隆抗体#2775。3868特异性高,2775灵敏度高,2775更容易识别LC3-I。 师兄又...
部分细胞本身LC3-I的基础水平就很低, LC3-I本身就很容易降解,也更易在SDS上样缓冲液中降解, 对反复冻融更为敏感。 目前的LC3抗体所检测的抗原表位都位于LC3的N端,由于PE基团结合可能导致N端区域的构象变化,使得抗体对LC3-II的亲和性更高,所以LC3-...
如果按照之前的LC3-II /LC3-I,可能会获得4h,6h自噬更强的结论,但事实上并不是这样的,通过加入溶酶体蛋白酶抑制剂如E64d和pepstatin A处理,我们可以得出结论,在0.5h自噬是最强的,后面逐渐减弱。 总结 首先一定要有蛋白酶体抑制剂的结果,帮忙我们判断药物对自噬的影响方式。其次由于抗体因素,LC3-II比LC3-I更容易...
接下来,将蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜上,并使用抗LC3的抗体进行免疫检测。最后,使用化学发光法或显色法观察和定量LC3的水平。 3. LC3转化:在自噬过程中,LC3 I会被ATG4蛋白酶切割,形成LC3 II。因此,LC3 II的水平可以反映自噬的活性。LC3转化可以通过观察LC3 I和LC3 II的比例来评估。当自噬活性增加时,LC3 II的...
翻到其中一页,给我讲到:目前的LC3抗体所检测的抗原表位都位于LC3的N端,由于PE基团结合可能导致N端区域的构象变化,使得抗体对LC3-II的亲和性更高。以CST抗体为例,LC3B的货号有单克隆抗体# 3868和多克隆抗体#2775。3868特异性高,2775灵敏度高,2775更容易识别LC3-I。
LC3-I和LC3-II的区分是理解自噬状态的关键，但要注意，抗体检测的抗原表位通常位于LC3的N端，这可能导致LC3-II/LC3-I比值的误差。进行LC3检测时，首要任务是评估样本的表达类型和量。对表达量低或不表达LC3的样本，自噬研究的结论可能不准确。LC3的动态平衡是关键，自噬小体的生成、融合和降解需要通过...
目前的 LC3 抗体所检测的抗原表位都位于 LC3 的 N 端,由于 PE 基团结合可能导致 N 端区域的构象变化,使得抗体对 LC3-II 的亲和性更高,所以 LC3-II 条带显色深并不能代表该样本处于高自噬状态。另外,LC3-I 对反复冻融更为敏感,也更易在 SDS 上样缓冲液中降解。基于以上两个原因,在半定量时,除了使用 ...