这一步用于去除游离的杂蛋白及非特异结合的蛋白。 常用的Wash Buffer:①PBS或TBS等,带有生理条件pH值和盐离子浓度的缓冲液;②低浓度(0.5-1%)温和的去污剂,如 NP-40, Triton-X-100等;③低或中强度的RIPA裂解液(一般首次实验不建议使用裂解液进行洗涤步骤操作,可能损失部分目的蛋白)。 实验要点: 出现非特异条...
IP/Co-IP Cell lysis buffer100ML1 B003-2IP/Co-IP Wash buffer 100ML 2 — 说明书—1 实验数据: B003用于IP/Co-IP检测。(1) 融合FLAG或HA 标签的质粒转染细胞,48小时后,使用B003-1裂解细胞,提取蛋白质。(2)使用W02 (anti-FLAG tag IP/Co-IP试剂盒) 或 W03(anti-HA tag IP/Co-IP试剂盒)进行IP...
这些还原剂可以使蛋白质分子的链内二硫键和链间二硫键断裂,使通过二硫键连接的各蛋白亚单位彼此分离,从而在电泳凝胶上显现清晰蛋白条带。 此外,某些特殊的5X蛋白上样缓冲液还添加了安全无毒的特殊荧光染料,如InstantView™ SDS-PAGE蛋白染色及上样缓冲液(5X),它能使蛋白在上样前与上样缓冲液的煮沸过程中被染色...
洗去非特异性结合。 Wash buffer: 盐离子浓度和去垢剂种类、浓度不同,造成洗涤的严格度不同 RIPA:洗涤严格度高,用于蛋白富集或翻译后修饰分析; Cell lysis buffer:Co-IP PBS:严格度最低,用于蛋白复合物分析 清洗流程: 加入500 μL Wash buffer; 重悬,颠倒数次; 4 ℃离心,弃上清; 重复4-5次。 6、洗脱 洗...
2.用IP Lysis/Wash Buffer将抗体以及制备好的样品稀释至500μL-800μL。 3.在4 ℃孵育2-4h或者过夜,以形成免疫复合物。 免疫沉淀: 注意:为保证磁珠均匀分布,使用前通过反复颠倒或轻微涡旋混匀瓶中磁珠。 1.将50-200µL的Protein A/G Magnetic Beads加入1.5 mL离心管中。
常用的Wash Buffer:①PBS或TBS等,带有生理条件pH值和盐离子浓度的缓冲液;②低浓度(0.5-1%)温和的去污剂,如 NP-40, Triton-X-100等;③低或中强度的RIPA裂解液(一般首次实验不建议使用裂解液进行洗涤步骤操作,可能损失部分目的蛋白)。 实验要点: 出现非特异条带时可以:①增加NaCl 浓度,降低由离子静电引起的相互...
Cell lysis buffer:Co-IP PBS:严格度最低,用于蛋白复合物分析 清洗流程: 加入500 μL Wash buffer; 重悬,颠倒数次; 4 ℃离心,弃上清; 重复4-5次。 6、洗脱 洗脱目的: 将蛋白从珠子上洗脱 变性洗脱与非变性洗脱: 洗脱流程: 加入3XSDS buffer 20-30μL,震荡、离心; ...
Cell lysis buffer:Co-IP PBS:严格度最低,用于蛋白复合物分析 清洗流程: 1 加入500 μL Wash buffer; 2 重悬,颠倒数次; 3 4 ℃离心,弃上清; 4 重复4-5次。 6)洗脱 洗脱目的: 将蛋白从珠子上洗脱 变性洗脱与非变性洗脱: 洗脱流程: 1 加入3XSDS buffer 20-30μL,震荡、离心; ...
2.收集细胞至1.5 mL EP管内,按比例加入Biolinkedin®IP Lysis/Wash Buffer,同时加入PMSF等相应的抑制剂,混匀后置于冰上静置5-20min(期间混匀几次)。 3.4 ℃,12000-16000 g,10 min离心收集上清液,置于冰上以备后续实验(或置于-80 ℃长期保存)。
1.6配置washing buffer+NP-40（NP-40溶液）：10ml washing buffer+100μl NP-40于15ml 离心管中。2、实验步骤 2.1取细胞六孔板，弃去培养液（移液枪），各加入1ml的PBS，用塑料铲子收集细胞，沿着圆周壁进行刮，将液体转移至1.5ml的离心管中；2.2离心，5000r/min，5min，4℃；真空泵移除上清液，重复离心...