1.未做IP实验，建议送细胞沉淀进行IP-MS检测。①细胞量不少于2×107（约两个10 cm培养皿，总蛋白量5mg左右）。一般来说，细胞量越多，IP-MS实验效果越理想。②其他样品：如组织、细菌和蛋白溶液等可根据蛋白含量进行换算。2.做完IP实验后，建议送Beads进行MS检测。①Beads用PBS缓冲液清洗干净，以Beads沉淀形式保...
IP-MS原理主要包括以下几个步骤: 1. 表达载体构建:将目标基因与荧光标签(如GFP)融合,构建表达载体。将构建好的载体转化到植物材料中,使目标基因表达并产生荧光信号。 2. 植物材料处理:将转化后的植物材料进行适当处理,如切片、破碎等,使细胞内的目标蛋白暴露出来。 3. 蛋白提取:利用蛋白提取试剂盒从植物材料中...
我们建议在目的蛋白的初次IP实验后,进行WB和考染/银染染色质控是必不可少的。 5、更多关于IP-MS的实验设计、实验材料、数据分析的介绍请关注公众号,接收后续更新。 6、本实验步骤为IP实验通用方法,各实验室应根据目的蛋白和抗体情况适当调整。其他亲和方式pull down仅可参考部分步骤。
在IP-MS实验中,非胶内酶切的方法通常包括以下步骤: 1. 细胞裂解,将含有目标蛋白的细胞用裂解缓冲液裂解,释放出蛋白质。 2. 免疫沉淀,将特异性抗体与目标蛋白结合,形成抗原-抗体复合物。然后使用蛋白A/G琼脂糖或磁珠来沉淀抗原-抗体复合物。 3. 洗涤,对沉淀后的复合物进行多次洗涤,以去除非特异性结合的蛋白质...
(2)IP-MS: 可以进一步定量分析蛋白的丰度和鉴定蛋白间的相互作用。 在定量分析中,关键指标包括Fold Change和Intensity。 Fold Change表示实验组与对照组间蛋白丰度的差异倍数。 Intensity则反映蛋白质的相对丰度。 根据实际情况设定合理的Fold Change阈值和P值,进而评估蛋白表达差异和统计学显著性。
免疫(共)沉淀与质谱联用即常说的Co-IP-MS / IP-MS(Co-Immunoprecipitation Mass Spectrum,Immunoprecipitation Mass Spectrum),是发现研究蛋白互作蛋白的一种重要利器。免疫共沉淀或免疫沉淀(Co-IP-MS / IP-MS)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法,是确定两种蛋白质在完整细胞...
答:IP-MS的完整流程通常包括: ①细胞裂解 ②细胞裂解液、抗体、Beads孵育 ③Beads清洗 ④蛋白洗脱 ⑤蛋白酶解和脱盐 ⑥质谱检测 ⑦数据分析 其中①-③步需由客户自行完成,实验步骤可参考《谱度众合 IP-MS 实验步骤》 样品可在第③步完成后寄送。WB等预实验可在第③步后分装样品进行。
IP-MS原理分为三个主要步骤:免疫沉淀、核心质谱分析和数据分析。 首先是免疫沉淀。实验开始时,科学家会使用抗体与感兴趣的蛋白结合。这些抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体,具体选择由实际需要决定。然后,这些抗体会与一些介质(如磁珠或琼脂糖)结合,以便后续的分离和富集。此时,生物样本中的目标蛋白也会结合在这些抗体...
步骤一：样本准备 在进行CO-IP-MS实验之前，首先需要准备样本。样本可以是细胞提取物、组织提取物或体液等。以下是样本准备的基本步骤：1.细胞培养：如果使用细胞样本，首先需要培养细胞并使其达到适当的生长状态。2.细胞裂解：将细胞收集并使用裂解缓冲液裂解细胞膜，释放细胞内的蛋白质。3.蛋白质浓度测定：使用蛋白...