2.4℃,4000 rpm离心5 min,弃去上清,该Sepharose上结合了GST-a融合蛋白; 3.加入200 μl预冷的PBS溶液,轻晃悬浮珠子,将Sepharose洗涤一次,4℃,4000 rpm离心5 min,弃去上清,重复此步骤3次; 4.最后一次用移液枪吸走珠子表面的液体,但注意不要吸走珠子,即可获得结合GST-a的Sepharose。 三、b蛋白的制备 b蛋白可...
GST pulldown实验流程图文详解。1️⃣ 蛋白的抽提与纯化原核表达蛋白分离纯化:(1)在裂解液上清中加入适量体积50%谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B,4℃摇床上缓慢摇动30~60min;(2)4℃,4000rpm离心5min,弃去上清;(3)加入200ul预冷的PBS溶液,轻晃悬浮珠子,洗涤一次,4℃,4000rpm离心5min,弃去上清,重复此步骤3次;(4)...
GST-Pull down 是在体外验证两种蛋白质结合的方法之一,其原理是目的蛋白与GST融合表达,蛋白固定在谷胱甘肽(GSH)亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支持物,起到“诱饵蛋白”的作用。 目标蛋白溶液通过柱子,从…
GST_pull_down操作流程 GST pull down操作流程 一、表达GST融合蛋白 1、6mlLB+单克隆+Amp,37℃,250rmp培养过夜 2、5ml菌液加入400ml LB+Amp的1L锥形瓶中中,37℃,250rmp,2h,OD600≈0.6-0.8 3、取1ml菌液保存于Ep管中,sample1 4、大瓶加入400ul(1:1000)IPTG,4h 5、取1ml菌液保存于Ep管中,sample2...
GST pull down操作流程 GST pull down操作流程 一、表达GST融合蛋白 1、6mlLB＋单克隆＋Amp，37℃，250rmp培养过夜 2、5ml菌液加入400ml LB＋Amp的1L锥形瓶中中，37℃，250rmp，2h，OD600≈0.6-0.8 3、取1ml菌液保存于Ep管中，sample1 4、大瓶加入400ul（1：1000）IPTG，4h 5、取1ml菌液保存于Ep...
gst pull-down实验流程GSTPulldown实验流程 一、实验准备阶段 1.确定实验目的 (1)确定进行GSTPulldown实验的目的和研究问题 (2)定义所需的实验指标和结果参数 2.准备实验材料 (1)准备所需的细胞或组织样本 (2)提取或购买GST标记的蛋白 二、样品处理与制备 1.细胞处理 (1)处理细胞以获得所需的细胞提取物 (2...
GST-pull down实验利用谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合的蛋白质(诱饵蛋白)与谷胱甘肽亲和树脂结合,从而捕获与之相互作用的蛋白质(捕获蛋白)。下面是具体步骤👇: 🌟蛋白表达与纯化: 将GST标签的质粒转化到大肠杆菌(如BL21感受态细胞)中。 诱导表达GST融合蛋白,收集细菌。
GST-PullDown步骤 GST-Pull Down 周一 早上：带有GST标签的ML-6P-1、GFP-6P-1保存菌划板（AMP+）晚上：挑斑，3-5ml摇菌过夜。周二 早上：带有His标签的s9-28a、S8-28a保存菌划板（kana+）晚上：挑斑，3-5ml摇菌过夜。早上：1.吸1ml过夜菌（ML、GFP）加入100ml培养基中，37℃，220rpm摇至OD=0.8左右...
备注:蛋⽩提取整个过程都在冰上操作,减少⾼温造成的蛋⽩降解,超声过程中最好不要有⽓泡产⽣,减少蛋⽩降解。总蛋⽩放在-20℃保存。 2、 GST pull-down 2.1 磁珠准备 1)将Glutathione MagBeads从4℃冰箱取出,上下颠倒混匀数次,使磁珠和溶液混合均匀,分别取30μL到2个⼲净的1.5mL Ep管中,记为...