gRNA (或称向导 RNA)是 CRISPR-Cas9 系统的一部分。gRNA 分子有两个组分:一个靶点特异性 CRISPR RNA (crRNA) 和一个辅助性的反式激活 crRNA (tracrRNA)。gRNA 通过 20-mer crRNA 序列与靶基因组序列之间的碱基配对,引导Cas蛋白复合物对相应位点进行切割,决定编辑位点特异性。 什么是SgRNA? sgRNA 代表单向导 R...
视频主要介绍如何在细胞中表达Cas9蛋白,利用CRISPR系统敲除靶基因 本视频主要介绍:gRNA的设计原理、PAM序列、Cas9蛋白原理
用CRISPY Cas9构建KO细胞系步骤: 1、设计gRNA序列,构建Cas9/gRNA 表达质粒。 2、转染。将表达质粒转染到细胞核中,使Cas9/gRNA表达,行使定位功能 3、敲除。定位后,切割细胞核中的对应序列,发生移码,使改基因突变无法表达目标序列。 1、目标基因序列,定位,结构(内含子,外显子,5',3’,编码序列和非编码序列),信号...
视频主要介绍如何在细胞中表达Cas9蛋白,利用CRISPR系统敲除靶基因 本视频主要介绍:gRNA的设计原理、PAM序列、Cas9蛋白原理
转染细胞的gRNA的制作(from颜泉梅):一.靶位点的选择:靶点按GN19NGG选择,其中方框内是靶位点,NGG是PAM区。合成带粘末端的靶点:(按下列要求合成两条引物),引物序列如下合成时,正义链:5’-CACC-GN19(含第一个G)-3’反义链:5’-AAAC-GN19(含第一个G,反向互补)-3’两条引物退火:Oligo110ul(10um)Oligo210ul...
这表明内源性外泌体能转运CRISPR-Cas9系统(图2)。此外,作者也通过tCLN和TRIF的方法验证了外泌体中gRNA的存在。此外通过对载体片段和未逆转录样品的PCR检测,也证明了外泌体中转运的是gRNA而不是过表达载体。 图2 CRISPR过表达细胞外泌体中含有Cas9蛋白和gRNA...
Cas9 蛋白/gRNA 转染试剂 GenomONE ®-GE EX GenomONE®-GE EX是将Cas9 蛋白以及向导RNA(gRNA)导入细胞的转染试剂。简单地操作即可将Cas9 蛋白和gRNA导入细胞,无需电穿孔类似的特别装置。即使是转染十分困难的免疫细胞,也可以实现Cas9 蛋白以及gRNA的高效导入。 ◆特点 ● 导入困难的免疫细胞亦可导入Cas9蛋白以及...
近日,来自日本九州大学生物化学系的Takashi Ito团队在《Cell Genomics》上发表研究论文:Strategic targeting of Cas9 nickase induces large segmental duplications,该研究开发了一种通过破坏复制叉进程以诱导结构变异的基因组编辑工具,作者将其命名为配对缺口诱导扩增(Paired Nicking-induced Amplification, PNAmp)。作者将两...
1、利用Cas9/gRNA体外细胞水平敲除基因的protocolCas9靶位点的选择1 .基因靶位点的选择遵循GGN(17-18)NGG(N为任意碱基)的序列要求, 其中GGN(17-18)是与靶基因结合的位点,NGG是Cas9蛋白切割所必须的PAM(protospacer-adjacentmotif)区。因为我们实验室所用的pU6-gRNA体外转录载体是U6启动子, 所以要求第一位碱基为G...
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造,将其连接在一起得到sgRNA (single guide RNA)。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接,得到可以同时表达两者的质粒,将其转染细胞,便能够对目的基因进行基因操作,在PAM (5’-NGG) 上游 ~3bp进行切...