The SAM system involves three lentivirus plamids.Lenti sgRNA(MS2) purohave BsmBI restriction enzyme site, which is for insertion of the oligo sgRNA under the hU6 promoter. The result sgRNA(MS2) lentivirus express the fused MS2 and speci...
另外，sgRNA工程改造也被证明可以提高基因激活的效率。通过将蛋白质相互作用RNA适体MS2添加到 sgRNA 中，实现了一种称为协同激活介体 (SAM) 系统的改进： MS2可招募p65AD与热休克因子1(HSF1)融合蛋白。与单独的 dCas9-VP64 相比，SAM 技术与 dCas9-VP64 结合使用，进一步增强了内源基因的激活效率。具体操作过程...
通过将蛋白质相互作用RNA适体MS2添加到 sgRNA 中,实现了一种称为协同激活介体 (SAM) 系统的改进: MS2可招募p65AD与热休克因子1(HSF1)融合蛋白。与单独的 dCas9-VP64 相比,SAM 技术与 dCas9-VP64 结合使用,进一步增强了内源基因的激活效率。具体操作过程:向实验细胞共转导两种分别携带dCas9:VP64和MS2:P65:HS...
CRISPR dCas9 SAM技术 CRISPR SAM(synergistic activation mediator)采用切割活性缺失的dCas9蛋白融合VP64转录激活蛋白,加上能与RNA结合蛋白MS2的sgRNA2.0,特异性识别并结合目标基因的启动子。MS2蛋白上连接p65和HSF1转录激活蛋白。通过多种转录激活蛋白的协同作用,能更好的模拟细胞内转录激活(图1,CRISPR/Cas9 SAM原理)...
CRISPRa的优势:与CRISPRi一致,CRISPRa可以激活内源基因组的转录,但不会改变靶基因位点基因组序列;无需预先了解靶标基因的天然调控机理,仅需知晓靶位点DNA序列的准确信息;使用SAM系统进行转录激活的基因通常可以得到较高水平的表达,但该系统需要三个载体共同作用,转染/感染难度相对较大。且目前尚未有sgRNA/MS2RNA靶向特...
CRISPRa的优势:与CRISPRi一致,CRISPRa可以激活内源基因组的转录,但不会改变靶基因位点基因组序列;无需预先了解靶标基因的天然调控机理,仅需知晓靶位点DNA序列的准确信息;使用SAM系统进行转录激活的基因通常可以得到较高水平的表达,但该系统需要三个载体共同作用,转染/感染难度相对较大。且目前尚未有sgRNA/MS2RNA靶向特...
为了增强激活能力,科学家们在dCas9-VP64的基础结构上开发了第二代dCas9-SAM(synergistic activation mediator,SAM)系统(图3),其中sgRNA经过修饰,可以募集额外的转录激活因子以达成协同激活作用。这种修饰的sgRNA包含了两段可结合噬菌体MS2外壳蛋白二聚体的发卡结构。MS2蛋白可以与另外的转录激活因子融合,这使得该系统具...
在第一代dCas9-SAM系统中,dCas9与典型的转录激活因子如VP64(单纯性疱疹病毒蛋白16的合成四聚体)或p65(参与许多细胞过程的转录因子)融合。这个系统可以在多种真核细胞的全基因组范围内进行基因激活,但只有中等程度的激活(2-5倍)。 为了增强激活能力,开发了二代dCas9-SAM系统。该系统建立在基本的dCas9-VP64结构...
CRISPRa的优势:与CRISPRi一致,CRISPRa可以激活内源基因组的转录,但不会改变靶基因位点基因组序列;无需预先了解靶标基因的天然调控机理,仅需知晓靶位点DNA序列的准确信息;使用SAM系统进行转录激活的基因通常可以得到较高水平的表达,但该系统需要三个载体共同作用,转染/感染难度相对较大。且目前尚未有sgRNA/MS2RNA靶向特...
2.1 CRISPR/dCas9-SAM系统激活效率验证与对照组相比,转染靶向血红蛋白HBG和肌联蛋白TTN的sgRNA表达载体后,HBG mRNA的表达水平上升10 000多倍;TTN mRNA的表达水平上升70倍,差异具有统计学意义(P<0.001)(图1)。表明CRISPR/dCas9-SAM系统可高效激活靶基因表达,该系统能够用于后续大规模激活基因表达并进行功能筛选。 图...