CUT&Tag是研究蛋白和DNA互作新兴的实验方法,该方法是通过蛋白特异性抗体引导Protein A-Tn5酶在目标蛋白结合的DNA位置进行切割,并且在序列两端加上测序接头,经过PCR扩增后形成可用于高通量测序的文库,随后对文库进行测序分析从而解析与目标蛋白结合的DNA片段。 CUT&Tag技术原理 02 实验流程 CUT&Tag实验流程较为简便,首先...
CUT&Tag技术的核心是pAG-Tn5融合蛋白（ChiTag），其中Protein AG能够结合抗体。在进行CUT&Tag实验时，首先将细胞与磁珠混合，然后进行靶蛋白特异性抗体（一抗）孵育，使抗体进入细胞与靶蛋白结合。为了放大信号，接着进行二抗孵育。最后孵育pAG-Tn5转座体，使得转座体进入细胞并与抗体结合，这样就把转座体间接的固定在...
qRT-PCR实验也证实,与WT相比,BBX29在aba3(ABA缺陷型)和abi1(ABA不敏感型)突变体中的表达只在小范围内波动(图2E)。这也说明冷胁迫下BBX29的表达主要受ABA非依赖性途径的调节。 5、BBX29在抗冷性中的负作用 为了探索BBX29在冷胁迫下的功能,作者构建了35S::BBX29-Myc过表达(OE)系,并获得了bbx29突变体。
在高质量的文库中,不需要进行CUT&Tag重复序列的去除。而当文库初始浓度、总量很少或者PCR扩增次数很多的时候,重复序列需要进行去除。不过因为很多数据都不能像此demo的数据一样,质量十分好,所以一般推荐把重复序列去除。特别是一些检测转录因子结合信号的,一般重复序列的比例都很高,不大可能是由CUT&Tag的特性导致的,更...
(1)CUT&Tag技术进行qPCR检测 事实证明,CUT&Tag实验所获取的DNA片段可以进行qPCR以检测目的条带的富集情况。CUT&Tag-qPCR与ChIP-qPCR类似,定量的长度、方法、引物设计等几乎完全一致。一般的实验流程为:细胞与磁珠结合—一抗孵育—二抗孵育—转座体孵育...
同时CUT&Tag可以对极少量细胞(60个细胞)进行操作,实现单细胞测序。Protein A-Tn5在细胞内进行核酸切割,PCR之前的反应都在细胞内进行。Henikoff博士通过分配单个细胞到5184纳米孔,再加入带随机标签的引物进行扩增的办法,实现单细胞测序。 图5. 单细胞CUT&Tag测序流程(Henikoff,2019) ...
全速涡旋样品约10 sec，混匀后瞬离，将样品置于PCR仪，55 ºC消化2 h (热盖不低于70 ºC)或者37 ºC过夜。CUT&Tag-qPCR方案目前做CUT&Tag-qPCR时，有两种，一种是蛋白酶K消化和gDNA提取后直接qPCR实验，一种是完成建库后进行qPCR。这两种方式都有文献可参考。目前翌圣更推荐完成建库后进行qPCR实验。qP...
CUT&Tag 将接头整合到 antibody-tethered pA-Tn5 附近的 DNA 中,整合的确切位点受到周围 DNA 可及性的影响。出于这个原因,具有相同的起始和结束位置的片段应该是常见的,并且这种“重复”可能不是 PCR 过程中产生的重复。在实践中,我们发现高质量的 CUT&Tag 数据集的 apparent 重复率很低,即使是 apparent “重复...
CUT&Tag 是蛋白质-DNA 互作关系研究的新方法，能在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA片段，是新一代超微量ChIP-Seq技术，适用于无ChIP级别抗体的蛋白研究。CUT&Tag 有望将蛋白与染色质 DNA 互作的研究变成了一种类似 PCR 反应的常规操作，对基因调控、表观遗传等领域的研究具有重要的意义。2.CUT...
同时CUT&Tag可以对极少量细胞(60个细胞)进行操作,实现单细胞测序。Protein A-Tn5在细胞内进行核酸切割,PCR之前的反应都在细胞内进行。Henikoff博士通过分配单个细胞到5184纳米孔,再加入带随机标签的引物进行扩增的办法,实现单细胞测序。 图5. 单细胞CUT&Tag测序流程(Henikoff,2019) PartIII 翌圣CUT&Tag产品重磅上...