舒桐医疗科技长期致力于CRISPR系统的开发和优化,除了上述提到的常用dCas9-CRISPRa/i体系,还有Cas12a和其他多种新型CRISPR核酸酶的CRISPR体系,从gRNA的PAM源头上提供更多有效选择。我们可提供sgRNA设计、质粒构建、稳定细胞系筛选、文库筛选等全流程服务!如有需求,欢迎咨询!
为了量化CRISPRi系统的抑制效率,作者设计了一个基于遗传回路(genetic circuit)的荧光报告系统,其中链球菌的dCas9由无水四环素(aTc)诱导,报告基因(mCherry)和sgRNA变体均组成型表达(图1A)。一旦将aTc添加到培养基中,dCas9–sgRNA–DNA 三元复合物就会阻断报告基因的转录,荧光水平可以指示 CRISPRi 系统的抑制效率。 作者...
然而,dCas9的结合受到核小体的影响,如果被组蛋白与DNA的结合所阻断,那么dCas9融合体可能无法实现其功能。Horlbeck等人于是利用筛选数据和转录起始位点分析来优化sgRNA的定位。他们生成了一种高度优化的sgRNA设计算法,可确定适合CRISPRi和CRISPRa应用的最佳sgRNA。这一平台大大改善了CRISPRi性能,提高了它的效率和特异性。
每个基因选择6个最佳的sgRNA,并分为两组,A和B。Sanson等人在A375细胞中筛选vemurafenib耐药的比较研究中证明,Calabrese文库比SAM文库方法鉴定出更多的hits。SAM系统(CRISPR / Cas9协同激活中介体)采用改进的激活剂设计,由无活性的Cas9 - VP64、带有两个MS2 RNA适配体的sg RNA和MS2 - P65 - HSF1辅助蛋白(Konerman...
Horlbeck等人于是利用筛选数据和转录起始位点分析来优化sgRNA的定位。他们生成了一种高度优化的sgRNA设计算法,可确定适合CRISPRi和CRISPRa应用的最佳sgRNA。这一平台大大改善了CRISPRi性能,提高了它的效率和特异性。 当然,CRISPRi和CRISPRa仍是相对年轻的技术。与CRISPR-ko或RNAi等成熟技术相比,它的应用还不是很广泛。
提供数据资源和预设计sgRNAs:研究提供了针对ENCODE SCREEN候选CREs的3,275,697个预设计的sgRNAs,这是一个为相关领域研究人员提供的重要资源,可以直接用于未来的功能性筛选实验。 ENCODE 非编码 CRISPR 筛选数据库的概况。(Credit:Nature Met...
利用sgRNA相隔错配的“钓鱼”策略,作者进一步证明基于dCas9的CRISPRi技术在神经元中具有精确的靶向特异性,几乎不会产生脱靶效应。因而,针对神经元特异的CRISPRi技术可用于快速地构建脑内基因特异性敲低的动物模型,能够大大缩短了研究时间和花费。 CRISPRi在小鼠脑内进行条件性敲低和多重敲低的设计示意图...
在hEF1α启动子下组成表达dCas9-SALL1-SDS3的U2OS细胞,使用DharmaFECT 4转染试剂,用50nM的混合sgRNAs或ON-TARGETplus SMARTpools (50nM)靶向RPA2、RPA1或RRM2,转染72小时后,将细胞固定,用抗磷酸化- h2ax抗体染色,并用Hoechst染色法鉴定细胞核。用细胞试剂盒进行DNA损伤反应试验。取重复板,分离总RNA, RT-...
为了阐明除ACE2以外的受体和蛋白酶在SARS-CoV-2感染中的功能,该研究通过使用过表达ACE2的iPS(ACE2 iPS)和CRISPRi系统抑制了BSG、CTSB和TMPRSS2基因的表达水平,并设计了针对这些基因的sgRNA。用表达sgRNAs、mKate2和抗病毒基因的质粒电转染iPS,如下图所示。
为了阐明除ACE2以外的受体和蛋白酶在SARS-CoV-2感染中的功能,该研究通过使用过表达ACE2的iPS(ACE2 iPS)和CRISPRi系统抑制了BSG、CTSB和TMPRSS2基因的表达水平,并设计了针对这些基因的sgRNA。用表达sgRNAs、mKate2和抗病毒基因的质粒...