(图2 CRISPR-Cas9系统诱发的双链DNA断裂触发的修复机制示意图) 2.gRNA设计 gRNA负责引导Cas9蛋白到靶基因编辑点,进行互补配对后,对DNA靶位点进行精准的切割。 (图3 gRNA设计原理示意图) 以TP53为例进行sgRNA设计: (1)进入CHOPCHOP网站,链接为:http://chopchop.cbu.uib.no/;输入框输入“TP53”,点击“Find Tar...
使用SnapGene软件对基因序列信息进行分析,如下图所示,WNT10B基因一共包含4个外显子,其中粉色区域为信号肽所在序列,该序列在蛋白质翻译加工过程中会被切除,sgRNA设计时应避免此段序列,最左边的的外显子序列也不参与蛋白质的翻译,也应该避免采用此段序列,所以最佳的sgRNA靶向...
（设计sgRNA的具体步骤已在敲除篇中详细介绍，本文略）（3）构建sgRNA-Cas9质粒 将设计好的sgRNA构建到PHB-pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)载体上。图6. PX459载体图 （4）设计donor质粒 ①设计并制作两端同源臂（homologous arm）：截取sgRNA靶点上游1000bp左右的序列，制作左同源臂（HA-L）；截取sgRNA靶点下游1000...
CRISPR-Cas9作为新一代的基因编辑技术,在基因功能研究、模式动物构建、基因治疗等方面具有广阔的应用前景。 该技术的原理是小向导RNA(sgRNA)引导cas9蛋白靶向基因组特定位点进行基因编辑。sgRNA序列特征、设计位置对于敲除的有效性及基因功能变化至关重要,那么s...
五、CRISPR-Cas9基因敲除步骤 步骤 描述 设计sgRNA 根据目标基因序列设计特定的单链引导RNA(sgRNA)。 构建编辑载体 将sgRNA和Cas9编码序列克隆到适当的载体中,如质粒或病毒载体。 细胞转染 将编辑载体导入目标细胞,可以使用电穿孔、脂质体介导转染或病毒介导转导等方法。
CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过单向导sgRNA识别目的基因组序列,引导Cas9核酸酶对基因组进行有效切割,形成DNA双链断裂,通过细胞自身修复机制实现基因敲除、敲入、突变等,达到基因编辑目的。由于CRISPR-Cas9技术靶向灵活、编辑效率高、操作简便等特点逐步被应用于基因改造、药物开发、遗传病治疗等方面。
CRISPR-Cas9基因敲除系统 实验流程: 1设计sgRNA 2构建sgRNA-Cas9载体 3构建sgRNA-Cas9稳转株 4 筛细胞克隆并进行qPCR验证 5 阳性克隆测序,选择敲除純合细胞株 6 筛选细胞单克隆测序 实验步骤: 1、设计sgRNA 针对小鼠LIF基因座(Musmusculus,NM_008501)设计了三种sgRNA。进行软件分析以确保sgRNA没有预测的脱靶结合位点...
Step 1 先找p53基因序列 1. NCBI--输入p53并选择物种human:tumor protein p53 [Homo sapiens (human)] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene image.png 2. Ctrl+F,输入sequence,快速定位(当然其实拉下去就是了),点击Genebank image.png 3. 下载p53基因序列 ...
基因敲除实验一般要经过以下几个过程：确定敲除目标基因及细胞→根据目标基因设计sgRNA序列→构建sgRNA及Cas9表达载体（质粒、病毒等）→转染细胞→筛选阳性混合克隆→挑选并培养单克隆→检测编辑效率，鉴定敲除类型→成功建立KO细胞系。本期内容，小编整理了几种CRISPR/Cas9系统编辑效率验证的常用方法，供小伙伴们参考。一...
按照基因本身的性质及实验目的，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。2.设计sgRNA 确定好作用的靶位点后，开始设计sgRNA序列。一般来...