注意：sgRNA的设计严格按照设计原则进行，需考虑所有候选靶点的序列、位置、正负链、GC含量、潜在的脱靶位点。三、sgRNA质粒的构建方法 1、酶切载体 LentiCRISPR-V2质粒有两个BsmBI酶切位点，通过使用BsmB内切酶I，我们能够打开所需的区域。酶切条件遵循内切酶说明书，随后进行胶切、回收并备用。2、寡核苷酸链引物退火...
1、质粒构建:构建好含有CRISPR-Cas9系统的质粒,其中包括lentiCRISPR-sgRNA。该质粒携带sgRNA序列,可指导Cas9蛋白准确识别并切割目标基因(之前已详细描述过)。 2、慢病毒包装质粒:准备慢病毒包装质粒,其中包括pCMV-VSV-G(携带包膜蛋白)和pCMV-dR8.2 dvpr(携带包装蛋白)。这两者协同作用,使得慢病毒能够高效地传递CRISPR-...
注意:sgRNA的设计严格按照设计原则进行,需考虑所有候选靶点的序列、位置、正负链、GC含量、潜在的脱靶位点。 三、sgRNA质粒的构建方法 1、酶切载体 LentiCRISPR-V2质粒有两个BsmBI酶切位点,通过使用BsmB内切酶I,我们能够打开所需的区域。酶切条件遵循内切酶说明书,随后进行胶切、回收并备用。 2、寡核苷酸链引物退火 ...
注意:sgRNA的设计严格按照设计原则进行,需考虑所有候选靶点的序列、位置、正负链、GC含量、潜在的脱靶位点。 三、sgRNA质粒的构建方法 1、酶切载体 LentiCRISPR-V2质粒有两个BsmBI酶切位点,通过使用BsmB内切酶I,我们能够打开所需的区域。酶切条件遵循内切酶说明书,随后进行胶切、回收并备用。 2、寡核苷酸链引物退火 ...
1、质粒构建:构建好含有CRISPR-Cas9系统的质粒,其中包括lentiCRISPR-sgRNA。该质粒携带sgRNA序列,可指导Cas9蛋白准确识别并切割目标基因(之前已详细描述过)。 2、慢病毒包装质粒:准备慢病毒包装质粒,其中包括pCMV-VSV-G(携带包膜蛋白)和pCMV-dR8.2 dvpr(携带包装蛋白)。这两者协同作用,使得慢病毒能够高效地传递CRISPR...
丢弃柱子,转移质粒溶液至干净的2 mL离心管中,保存。 15)配制1%琼脂糖凝胶,点胶鉴定质粒质量。 擎科CRISPR/Cas9质粒构建流程 -- 好物推荐 -- 擎科生物Cas9 sgRNA质粒构建: 系统 类型 备注 单质粒系统 单条/四条sgRNA 适用于Lenti CRISPR v2系列、px458和px459 NC...
三、sgRNA质粒的构建方法 1、酶切载体 LentiCRISPR-V2质粒有两个BsmBI酶切位点,通过使用BsmB内切酶I,我们能够打开所需的区域。酶切条件遵循内切酶说明书,随后进行胶切、回收并备用。 2、寡核苷酸链引物退火 体系: 退火参数: 37℃ 30 分钟,95℃ 5 分钟,然后以每分钟降低5℃的速度将温度降到25℃ ...
大家好!今天我们来聊聊如何构建CRISPR/Cas9质粒。首先,我们选择了一个名为Lenti-v2的质粒作为backbone,这是张峰老师实验室开发的。构建方法采用的是同源重组技术,具体步骤可以参考之前的笔记哦。酶切位点的选择是关键,我们使用了BsmBI-v2酶,它的反应温度是55℃。这个酶有两个切割位点,分别位于U6 promoter和gRNA scaff...
在载体构建阶段,需要将质粒与表达载体进行连接。这一步骤通常使用DNA连接酶来完成。首先,将质粒和表达载体进行双酶切,产生互补的黏性末端。然后,通过连接酶将这些互补的黏性末端连接在一起,形成重组DNA分子。最后,将重组DNA分子转入宿主细胞中进行培养和扩增。
CRISPR/Cas9质粒的构建 1.线性化载体; 2. sgRNA双链结合; 3. sgRNA与载体连接; 4. 菌P鉴定。 基因敲除效果鉴定1.Western检测蛋白表达量;2.双sgRNA敲除,间隔200-500bp左右。鉴定引物设计在两个gRNA外侧。 产品: 单基因/多基因敲除细胞系构建 小片段敲除方案,基因敲除细胞方案 ...