设计好与靶序列互补配对的gRNA序列后，我们需要将gRNA构建至相应的敲除载体上，目前常用的方法是利用限制性内切酶酶切形成粘性末端后连接gRNA，所以需要根据我们使用的Cas9-gRNA质粒的酶切位点选择合适的接头。举例说明，若我们选用BsmBI为酶切位点的载体，BsmBI的接头如下图2所示，图2. BsmBI的接头设计 当我们锁定P...
8、复制那段外显子的序列到sgRNA设计网站，http://crispor.tefor.net/（网站有很多）；9、输入上述已选中的同源区域的碱基序列，选择正确的物种和Cas9蛋白；10、网站生成的sgRNA序列信息如下，包括sgRNA序列、PAM、此网站提供的特异性评分、切割效率评分、以及潜在的脱靶具体信息（建议sgRNA设计3-4条，利于高效完成）...
1、质粒构建:构建好含有CRISPR-Cas9系统的质粒,其中包括lentiCRISPR-sgRNA。该质粒携带sgRNA序列,可指导Cas9蛋白准确识别并切割目标基因(之前已详细描述过)。 2、慢病毒包装质粒:准备慢病毒包装质粒,其中包括pCMV-VSV-G(携带包膜蛋白)和pCMV-dR8.2 dvpr(携带包装蛋白)。这两者协同作用,使得慢病毒能够高效地传递CRISPR-...
2. 将sgRNA-Cas9、修复DNA模版共转目的细胞用lipofiter3.0转染试剂将上述两种质粒转染至目的细胞。3. 嘌呤筛选，检测荧光 本例子做的荧光蛋白敲入可以直接根据红色荧光信号进行分选。而其他的基因敲入需要根据gRNA质粒里面的荧光进行筛选或者进行puro抗性筛选，然后通过PCR等手段检测基因是否敲入。4. PCR检测基因组 为了证...
今天我们先来分享第一步——分子克隆,构建sgRNA和Cas9共表达载体。你可以根据自己的细胞类型选择最适合的质粒。这里我们以HEK 293T细胞为例,因为这种细胞最容易转染。你只需要从Addgene购买pSpCas9(BB)质粒,然后设计合成所需要的sgRNA,大约20多个bp。接着,用T4连接的方式把sgRNA和Cas9连接起来,一个共表达sgRNA和...
三、sgRNA质粒的构建方法 1、酶切载体 LentiCRISPR-V2质粒有两个BsmBI酶切位点,通过使用BsmB内切酶I,我们能够打开所需的区域。酶切条件遵循内切酶说明书,随后进行胶切、回收并备用。 2、寡核苷酸链引物退火 体系: 退火参数: 37℃ 30 分钟,95℃ 5 分钟,然后以每分钟降低5℃的速度将温度降到25℃ ...
1. 构建sgRNA-Cas9质粒及修复DNA模板质粒 (1)确定敲入位点 ①若敲入的片段不参与翻译,则在想插入的附近设计sgRNA即可,并且根据sgRNA位置附近的序列设计donor载体(关于donor载体的设计在后文会详细介绍)。 ②若敲入的基因参与翻译,并只是想让该蛋白表达蛋白,那么将外源基因插入到基因组中的safe harbor位点则是一个很好...
通常使用质粒载体或病毒载体等方法来将Cas9和sgRNA导入细胞。目前慢病毒是构建基因敲除细胞株的最佳工具，通过将编码Cas9蛋白的序列和sgRNA序列克隆至慢病毒穿梭质粒中，再用包装好的病毒感染细胞。4.实验细胞感染及基因敲除 利用慢病毒感染实验细胞，细胞成功表达Cas9和sgRNA。Cas9蛋白在sgRNA引导下对细胞基因组的靶标基因...
三、sgRNA质粒的构建方法 1、酶切载体 LentiCRISPR-V2质粒有两个BsmBI酶切位点,通过使用BsmB内切酶I,我们能够打开所需的区域。酶切条件遵循内切酶说明书,随后进行胶切、回收并备用。 2、寡核苷酸链引物退火 体系: 退火参数: 37℃ 30 分钟,95℃ 5 分钟,然后以每分钟降低5℃的速度将温度降到25℃ ...
载体构建 3. 根据设计的 sgRNA 序列,合成 Oligo DNA。酶切带有 Cas9 基因的空载体(带有荧光标签(GFP)和筛选基因(嘌呤霉素))得到线性化质粒,混合 Oligo DNA与线性化空载体,以T4 连接酶连接,添加 buffer 与 ddH2O,16℃连接过夜。 质粒验证 4. 将连接产物转入DH5α大肠杆菌,37℃培养过夜。挑选单菌落进行扩增,...