8、复制那段外显子的序列到sgRNA设计网站,http://crispor.tefor.net/(网站有很多); 9、输入上述已选中的同源区域的碱基序列,选择正确的物种和Cas9蛋白; 10、网站生成的sgRNA序列信息如下,包括sgRNA序列、PAM、此网站提供的特异性评分、切割效率评分、以及潜在的脱靶具体信息(建议sgRNA设计3-4条,利于高效完成); 11...
CRISPR慢病毒转染法是一种高效引入CRISPR基因编辑系统到目标细胞中的技术,旨在实现对基因的有针对性编辑或调控。 实验步骤: 1、质粒构建:构建好含有CRISPR-Cas9系统的质粒,其中包括lentiCRISPR-sgRNA。该质粒携带sgRNA序列,可指导Cas9蛋白准确识别并切割目标基因(之前已详细描述过)。 2、慢病毒包装质粒:准备慢病毒包装质...
若要引发移码突变,必须将sgRNA设计在CDS区域,最好靠近编码蛋白的N端,最理想的位置是位于第一或第二外显子上,以生成无功能性蛋白。当基因存在多个转录本时,最好将sgRNA设计在同源区域。 总之,sgRNA的设计和质粒构建是CRISPR-Cas9系统的关键步骤,需要根据目标基因的信息和sgRNA的设计原则进行精确设计。通过不断优化sgRN...
8、复制那段外显子的序列到sgRNA设计网站,http://crispor.tefor.net/(网站有很多); 9、输入上述已选中的同源区域的碱基序列,选择正确的物种和Cas9蛋白; 10、网站生成的sgRNA序列信息如下,包括sgRNA序列、PAM、此网站提供的特异性评分、切割效率评分、以及潜在的脱靶具体信息(建议sgRNA设计3-4条,利于高效完成); 11...
该复合物通过sgRNA的spacer序列导引Cas9蛋白高度特异性地结合至目标DNA,触发Cas9的内切酶活性,引发目标DNA的双链断裂。 细胞察觉到断裂后,启动修复机制,包括非同源末端连接和同源重组,以实现基因组的精准编辑,为疾病治疗和基因研究提供了创新性工具。 一、sgRNA的设计原则 ...
11、设计好的引物送引物公司设计合成。 注意:sgRNA的设计严格按照设计原则进行,需考虑所有候选靶点的序列、位置、正负链、GC含量、潜在的脱靶位点。 三、sgRNA质粒的构建方法 1、酶切载体 LentiCRISPR-V2质粒有两个BsmBI酶切位点,通过使用BsmB内切酶I,我们能够打开所需的区域。酶切条件遵循内切酶说明书,随后进行胶切...
该复合物通过sgRNA的spacer序列导引Cas9蛋白高度特异性地结合至目标DNA,触发Cas9的内切酶活性,引发目标DNA的双链断裂。 细胞察觉到断裂后,启动修复机制,包括非同源末端连接和同源重组,以实现基因组的精准编辑,为疾病治疗和基因研究提供了创新性工具。 一、sgRNA的设计原则 ...
该复合物通过sgRNA的spacer序列导引Cas9蛋白高度特异性地结合至目标DNA,触发Cas9的内切酶活性,引发目标DNA的双链断裂。 细胞察觉到断裂后,启动修复机制,包括非同源末端连接和同源重组,以实现基因组的精准编辑,为疾病治疗和基因研究提供了创新性工具。 一、sgRNA的设计原则 ...