目前应用最广泛的CRISPR/Cas系统是来源于酿脓链球菌 (Streptococcus pyogenes) 的CRISPR Cas9系统。2012年,Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier证明CRISPR Cas9系统可以在体外切割双链DNA [1];2013年,张锋首次用CRISPR/Cas9系统在原核生物 (大肠杆菌) 中实现基因组编辑 [2]。 天然
一、什么是CRISPR-Cas9?它有多重要? 1. 概念速览:从细菌的“免疫武器”到基因编辑的“魔剪” 2. 为什么它如此火爆?颠覆传统,开启基因编辑新时代 二、CRISPR-Cas9的原理:精准制导,双链断裂,巧妙修复 1. 自带“指南针”的精准打靶:gRNA与Cas9的完美配合 2. DNA修复机制随之开启:细胞的自我保护与我们的“小心机...
图4. CRISPR-Cas9介导的DNA干扰细菌适应性免疫 将Cas9中切割域突变(如D10A和H840A突变),就会使Cas9蛋白失去对DNA的切割活性,但不影响其与DNA的结合能力,这种失去DNA切割活性的Cas9蛋白被命名为Dead Cas9(dCas9)。 dCas9蛋白结合DNA后,通过CRISPR激活(CRISPRa)和CRISP...
CRISPR-Cas9 技术的效率是个很关键的挑战。虽说 Cas9 蛋白质能够把目标 DNA 切开，可修复过程的效率却不高。尤其是 HDR 修复机制，效率特别低，原因是在细胞里 NHEJ 修复机制更常见。科学家们努力的方向在于提升 CRISPR-Cas9 技术的效率，像优化 sgRNA 的设计呀、改良 Cas9 蛋白质的性能啊，还有寻找更管用的修复...
基因组编辑资源库 CRISPR 技术信息 TALEN 技术信息 革命性的 CRISPR-Cas9 技术正在不断革新基因组编辑领域。CRISPR-Cas9 系统能够实现高度灵活性和特异性靶向性,可进行修饰和重定向,也已成为干细胞工程、基因治疗、组织和动物疾病模型以及设计抗病转基因植物等广泛应用中的强大基因组编辑工具...
CRISPR-Cas9基因编辑技术主要有两种应用方式: 1.基因敲除(Knockout):通过CRISPR-Cas9在目标基因上引入双链断裂(DSB),细胞通过非同源末端连接(NHEJ)修复机制修复断裂,过程中可能引入插入或缺失(indels)突变,导致目标基因功能丧失。 2.基因插入或替换(Knockin):利用同源重组(HDR)机制,在目标基因上引入特定的突变或外源序...
CRISPR-Cas9基因编辑载体构建 在植物中进行基因编辑通常需要同时构建Cas基因表达盒和sgRNA表达盒。Cas基因的表达通常由35S或Ubi等RNA聚合酶II启动子驱动,以Nos终止子或其他终止子终止;sgRNA表达盒比较小,一般由长约300 bp的U3或U6等RNA聚合酶III启动子驱动,以连续6个以上的T碱基终止即可。目前常用的基因编辑载体骨架所...
三、CRISPR - Cas9系统的作用机制 （一）CRISPR - Cas9系统的组成部分 1. crRNA（CRISPR RNA）crRNA是CRISPR - Cas9系统中重要的RNA成分之一。它是由CRISPR基因座转录产生的，包含了与靶DNA序列互补的引导序列。这个引导序列决定了Cas9蛋白将在基因组中的哪个位置发挥作用。2. tracrRNA（trans - activating crRNA）t...
CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过单向导sgRNA识别目的基因组序列,引导Cas9核酸酶对基因组进行有效切割,形成DNA双链断裂,通过细胞自身修复机制实现基因敲除、敲入、突变等,达到基因编辑目的。由于CRISPR-Cas9技术靶向灵活、编辑效率高、操作简便等特点逐步被应用于基因改造、药物开发、遗传病治疗等方面。
一、CRISPR基因敲入实验原理 CRISPR-Cas9基因敲入（KI, Knok in）是指Cas9内切酶切割双链DNA时，同时提供一段与靶基因高度同源的DNA修复模板，生物体即可启动HDR修复路径，将一段外源DNA定点插入基因内部。KI的外源基因可以是具有蛋白表达功能的编码基因，可以是参与基因调控的DNA元件，也可以是一段没有功能的DNA序列等...