特异性:dCas9-KRAB CRISPRi系统可实现高效抑制同时,几乎没有脱靶现象。 不足之处 不同基因之间差异性:由于dCas9-KRAB需要接触到目的基因的调控序列,因此会因为基因所处染色体位置不同而产生不同的抑制程度,这取决于它们的内源染色质状态。
Gilbert将dCas9蛋白与KRAB结构域融合,构建dCas9-KRAB融合蛋白,该融合蛋白可以在sgRNA的指导下特异性地靶向EGFP载体以降低荧光活性(Gilbert Luke A et al.,2013)。研究表明dCas9-KRAB通过将甲基转移酶SETDB1招募到靶点来对靶基因进行甲基化修饰从而抑制靶基因的表达。dcas9-KRAB还可以靶向基因调控元件,例如,dCas9-KRA...
Gilbert将dCas9蛋白与KRAB结构域融合,构建dCas9-KRAB融合蛋白,该融合蛋白可以在sgRNA的指导下特异性地靶向EGFP载体以降低荧光活性(Gilbert Luke A et al.,2013)。研究表明dCas9-KRAB通过将甲基转移酶SETDB1招募到靶点来对靶基因进行甲基化修饰从而抑制靶基因的表达。dcas9-KRAB还可以靶向基因调控元件,例如,dCas9-KRA...
Gilbert将dCas9蛋白与KRAB结构域融合,构建dCas9-KRAB融合蛋白,该融合蛋白可以在sgRNA的指导下特异性地靶向EGFP载体以降低荧光活性(Gilbert Luke A et al.,2013)。研究表明dCas9-KRAB通过将甲基转移酶SETDB1招募到靶点来对靶基因进行甲基化修饰从而抑制靶基因的表达。dcas9-KRAB还可以靶向基因调控元件,例如,dCas9-KRA...
图6 dCas9-KRAB转录抑制系统(Gilbert et al., 2014)。 2 表观基因组编辑 表观基因组是基因组调控的第二级,涉及核小体中组蛋白的DNA甲基化和共价翻译后修饰。组蛋白修饰会改变核小体的净电荷,从而影响DNA和组蛋白之间以及组蛋白本身在核小体间和核内水平上的相互作用。表观遗传调节往往是通过影响一段染色质...
图1. Cas9及dCas9工作原理图: A.cas9基因编辑; B.dcas9调控基因表达(Dominguez AA et al.,2016) 二、CRISPRi:dcas9与基因抑制 CRISPRi即将抑制基因转录的效应器融合到cas9蛋白上,在sgRNA的引导下,转录抑制效应蛋白与靶基因相关元件作用抑制靶基因的转录表达,目前常用的CRISPRi工具有:dCas9-KRAB,dCas9-DNMT3A,...
因此我们开发了dCas9-KRAB系统,在这个系统中,dCas9与Kox1的转录阻遏物结构域KRAB(Krüppel-associated box)融合(图3a)。这种增强的CRISPRi系统依靠KRAB募集各种各样的组蛋白修饰因子,通过形成异染色质的方式可逆地抑制基因表达。该系统,在瞬时转染期间可以高度特异性地使内源性真核基因表达降低60-80%(图3b)。此外,...
dCas9-KRAB CRISPRi慢病毒载体系统主要包含gRNA表达载体和dCas9-KRAB表达载体两部分，设计基因抑制实验时仅需构建gRNA表达载体。这一系统的优势在于不改变内源基因组背景，能实现高水平的基因抑制效果，适用于多种转录本的抑制，并且具有较高的特异性，几乎无脱靶现象。然而，dCas9-KRAB CRISPRi系统在基因...
在小鼠中通过RAB-dCas9和ZFP-KRAB原位抑制NaV1.7的示意图 紧接着，研究团队在实验小鼠身上进行了脊髓注射来测试这个系统，这些小鼠因炎症或化疗而引起了慢性疼痛症状。令人鼓舞的是，研究人员发现，接受治疗的小鼠比对照组小鼠表现出更高的疼痛阈值。具体表现为，经过治疗的小鼠在疼痛刺激（如热、冷和受压等）下撤回...
除在肝脏中证实了小鼠模型的有效性外，研究者还指出，LSL-dCas9-p300core (dCas9p300)小鼠模型还可用于神经系统中基因表达的条件性激活：在原代培养的小脑颗粒细胞和小鼠脑中表达Cre重组酶可成功的诱导Grin2c和Fos基因的特异性激活并改变神经元的电生理特性。之后研究者发现，给Rosa26-LSL-dCas9-KRAB (dCas9KRAB)...