为模拟后一种情况,本研究将原来的pCas(p15a-Cas-S1)和pTarget(pColE-CTR)的质粒骨架进行了互换,构建了新的双质粒系统(图1)。新的pTarget质粒p15a-CTR的拷贝数低于新的pCas质粒pColE-Cas-S1,可用于 “低拷贝入侵者干涉实验”(low c...
一体化质粒系统包含一个Cas蛋白,一个或两个sgRNA,一个同源修复模块,一个启动子和其他相关元件。文章中验证了三种Cas蛋白(FnCas12、SpRY、SpCas9)对多形拟杆菌中果糖基碳水化合物基因的编辑效率,结果显示当Cas蛋白表达由可诱导的P1TDPGH023启动子控制时,通过aTC(无水四环素)诱导后,三种Cas蛋白的编辑效率分别接近60%...
双特异性纳米系统的构建 首先,用P3启动子构建一种嵌合肝脏特异性启动子的Cas编辑器的质粒,使得其仅在肝实质细胞中具有活性。其次,通过聚二硫键 (PD)浓缩质粒以形成 PD/质粒 (PD/P) 纳米复合物,最后,在PD/P 纳米复合物表面包覆一层仿生...
目前应用最广泛的CRISPR/Cas系统是来源于酿脓链球菌 (Streptococcus pyogenes) 的CRISPR Cas9系统。2012年,Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier证明CRISPR Cas9系统可以在体外切割双链DNA [1];2013年,张锋首次用CRISPR/Cas9系统在原核生物 (大肠杆菌) 中实现基因组编辑 [2]。 天然的CRISPR-Cas9系统由三部分组成:Sp...
图5. CRISPR/Cas系统表达形式，包括编码gRNA和Cas蛋白的质粒，Cas mRNA或circRNA混合物和gRNA，以及Cas蛋白与gRNA的复合物 各种形式各有优缺点，circRNA的表达形式是其中最优前景和发展潜力的。① 质粒 优点：相对稳定，成本低，易于制造；缺点：转染和表达效率低；整合到基因组的风险大；Cas蛋白较大，导致质粒碱基数...
基于该原理, 研究者构建了两种质粒, 一种质粒能够对外来的特性生理信号做出反应, 并随之扩增; 另一种质粒则能表达CRISPR-Cas系统元件。根据设想, 当没有外来生理信号出现时, CRISPR表达质粒会不断地向细菌的CRISPR位点插入空白序列; 当有外来信号出现时, 前一种质粒就会启动并扩增, 在CRISPR位点上留下印记。经过...
——CRISPR/Cas9系统的形式 在实际应用中,可通过细胞转染、腺相关病毒(AAV)、慢病毒等病毒包装,外泌体包装,LNPs包封等方式向胞内或体内或胞内递送质粒、Cas蛋白和sgRNA、mRNA和sgRNA、环状RNA(circRNA)和sgRNA等,从而在体内或胞内表达CRISPR/Cas9系统,达到基因编辑的目的。
改造后的 CRISPR/Cas9 将 tracrRNA 和 crRNA 融合成一条单链引导 RNA （sgRNA）。sgRNA 可以从单个质粒表达，用于直接转染或包装成用于病毒转导的颗粒。另外，可通过与一些荧光物质融合，来可视化活细胞中的内源性基因组位点。如下图的荧光小分子 DFHBI （HY-110250）。图 4. DFHBI 用于检测 Cas 核酸酶活性 第三...
在基因编辑技术的CRISPR/Cas体系中，基于同源介导修复 (homology directed repair, HDR) 机制开展的基因敲入是其重要应用之一，合适的HDR模板是决定基因敲入成败与效率的重要因素。三、CRISPR基因敲入实验流程步骤 （以敲入RFP蛋白为例）1. 构建sgRNA-Cas9质粒及修复DNA模板质粒 （1）确定敲入位点 ①若敲入的片段不参与...
CRISPRs附近的基因早先被理解为DNA修复系统的一部分，但后来发现它们主要与 CRISPR基因伴生，因此被称为CRISPR相关（CRISPR-associated，Cas）基因。2005年，Mojica等人发现细菌中的这种间隔序列大部分来自外源DNA，并且发现病毒更有可能感染没有同源间隔序列的细胞，因此猜测CRISPR 参与了细菌抵抗外部噬菌体感染或质粒转移等...