一体化质粒系统包含一个Cas蛋白,一个或两个sgRNA,一个同源修复模块,一个启动子和其他相关元件。文章中验证了三种Cas蛋白(FnCas12、SpRY、SpCas9)对多形拟杆菌中果糖基碳水化合物基因的编辑效率,结果显示当Cas蛋白表达由可诱导的P1TDPGH023启动子控制时,通过aTC(无水四环素)诱导后,三种Cas蛋白的编辑效率分别接近60%...
目前应用最广泛的CRISPR/Cas系统是来源于酿脓链球菌 (Streptococcus pyogenes) 的CRISPR Cas9系统。2012年,Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier证明CRISPR Cas9系统可以在体外切割双链DNA [1];2013年,张锋首次用CRISPR/Cas9系统在原核生物 (大肠杆菌) 中实现基因组编辑 [2]。 天然的CRISPR-Cas9系统由三部分组成:Sp...
CRISPR-Cas系统是存在于原核生物细菌和古细菌中的一类保守的免疫系统,是作为对抗噬菌体感染和质粒转移的防御机制而自然进化得来的。2012年首次报道CRISPR-Cas9可通过RNA引导的Cas9核酸酶,对DNA进行切割,实现基…
基于该原理, 研究者构建了两种质粒, 一种质粒能够对外来的特性生理信号做出反应, 并随之扩增; 另一种质粒则能表达CRISPR-Cas系统元件。根据设想, 当没有外来生理信号出现时, CRISPR表达质粒会不断地向细菌的CRISPR位点插入空白序列; 当有外来信号出现时, 前一种质粒就会启动并扩增, 在CRISPR位点上留下印记。经过...
双特异性纳米系统的构建 首先,用P3启动子构建一种嵌合肝脏特异性启动子的Cas编辑器的质粒,使得其仅在肝实质细胞中具有活性。其次,通过聚二硫键 (PD)浓缩质粒以形成 PD/质粒 (PD/P) 纳米复合物,最后,在PD/P 纳米复合物表面包覆一层仿生...
他们随后构造出一种双质粒RNA靶向CRISPR系统,该系统在不同的质粒上表达向导RNA(gRNA)和Cas13a基因,其中Cas13a基因含有一种经过改造的核定位序列(nuclear localization sequence)。在人细胞系中,这种CRISPR-Cas13a构造物高效地切割报告质粒(reporter plasmid)中转录的RNA和三种内源性基因转录的RNA。
表1 CRISPR-Cas系统分类及作用机制 Table 1 Classification and action mechanism of CRISPR CAS system 注:Cascade(抗病毒防御的CRISPR相关复合物) 3 CRISPR-Cas9在乳酸菌中的应用 3.1 基因编辑工具 3.1.1 传统基因编辑工具 目前已经开发了多种乳酸菌基因编辑技术:基于质粒的同源重组交换技术、线性DNA重组技术和基于...
CRISPR/Cas系统免疫机制 CRISPR/Cas系统发挥免疫作用主要经过3个阶段:适应阶段(Adaptation),表达阶段(Expression)和干扰阶段(Interference)[12,13]。 ◆适应阶段 spacer捕获阶段,细菌识别出外源性DNA(病毒或者质粒),并且将其作为一个新的spacer整合到CRISPR位点前导序列的末端。
图5. CRISPR/Cas系统表达形式，包括编码gRNA和Cas蛋白的质粒，Cas mRNA或circRNA混合物和gRNA，以及Cas蛋白与gRNA的复合物 各种形式各有优缺点，circRNA的表达形式是其中最优前景和发展潜力的。① 质粒 优点：相对稳定，成本低，易于制造；缺点：转染和表达效率低；整合到基因组的风险大；Cas蛋白较大，导致质粒碱基数...