9、输入上述已选中的同源区域的碱基序列，选择正确的物种和Cas9蛋白；10、网站生成的sgRNA序列信息如下，包括sgRNA序列、PAM、此网站提供的特异性评分、切割效率评分、以及潜在的脱靶具体信息（建议sgRNA设计3-4条，利于高效完成）；11、设计好的引物送引物公司设计合成。注意：sgRNA的设计严格按照设计原则进行，需考虑所有...
7、构建T7/U6启动子驱动sgRNA表达载体时,需注意sgRNA的5'碱基最好为G,或者人为添加一个G来提高其转录效率。 8、若要引发移码突变,必须将sgRNA设计在CDS区域,最好靠近编码蛋白的N端,最理想的位置是位于第一或第二外显子上,以生成无功能性蛋白。 9、当基因存在多个转录本时,最好将sgRNA设计在同源区域。 二、...
7、构建T7/U6启动子驱动sgRNA表达载体时,需注意sgRNA的5'碱基最好为G,或者人为添加一个G来提高其转录效率。 8、若要引发移码突变,必须将sgRNA设计在CDS区域,最好靠近编码蛋白的N端,最理想的位置是位于第一或第二外显子上,以生成无功能性蛋白。 9、当基因存在多个转录本时,最好将sgRNA设计在同源区域。 二、...
CRISPR-Cas9基因组编辑技术的基本原理为将tracrRNA:crRNA设计为sgRNA,sgRNA包含位于5′端的靶DNA的互补序列,以及位于3′端的tracrRNA:crRNA的类似序列,crRNA 或sgRNA包含一个20nt指导序列可以直接匹配的靶位点,利用靶DNA的互补序列来定位需编辑的位点,利用tracrRNA:crRNA的类似序列与Cas9结合,实现目标基因定向基因组改造。
5、避免RNA结构影响:确保sgRNA序列不包含稳定的二级结构,以提高在实验条件下的有效性。 6、避免选择在基因组上匹配到多个位点的sgRNA,可通过sgRNA设计软件筛选出移码突变率高且脱靶位点较少的sgRNA。 7、构建T7/U6启动子驱动sgRNA表达载体时,需注意sgRNA的5'碱基最好为G,或者人为添加一个G来提高其转录效率。
1. 设计sgRNA（单导RNA）目标序列选择：选择靶基因的特定位点，确保附近有PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列。设计sgRNA：根据靶基因的目标序列设计与其互补的sgRNA。可以使用在线工具（如CRISPR Design Tool）来设计和验证sgRNA序列。2. 构建CRISPR-Cas9表达载体 载体选择：选择合适的载体来表达Cas9蛋白和sgRNA。常用...
CRISPR操作指南-载体构建和细胞建系教程 设计完sgRNA之后,就可以选择性克隆到此目的载体了。在这里我们选择lentiCRISPR v2载体作为例子说明。lentiCRISPRv2是张锋实验室发布一个慢病毒载体系统,cas9和sgRNA表达框在同一载体上。而且Cas9的C端带有FLAG融合标签,载体包含Puromycin抗性基因,适合建稳转系(图21)。验证sgRNA活性...
1.4 点击其中一条sgRNA序列,会看到sgRNA在TP53基因上的具体作用位置; “ 2. sgRNA重组构建 ” 以lentiCRISPRv2载体为例,说明sgRNA是如果构建到该载体中。首先,将设计好的sgRNA中的U碱基改成T碱基,如TP53基因的sgRNA序列为5’-CAUUGCUUGGGACGGCAAGG-3’,修改后的碱基为5’-CATTGCTTGGGACGGCAAGG-3’,该序列的...
1. 构建sgRNA-Cas9质粒及修复DNA模板质粒 （1）确定敲入位点 ①若敲入的片段不参与翻译，则在想插入的附近设计sgRNA即可，并且根据sgRNA位置附近的序列设计donor载体（关于donor载体的设计在后文会详细介绍）。②若敲入的基因参与翻译，并只是想让该蛋白表达蛋白，那么将外源基因插入到基因组中的safe harbor位点则是一...