CRISPR/Cas9系统由Cas9内切酶和sgRNA组成：Cas9内切酶蛋白：含RuvC和HNH样核酸酶结构域，具有切割双链DNA的功能，能识别PAM基序（5’-NGG），并在PAM基序上游第3个碱基处切割双链DNA。sgRNA：为tracrRNA和crRNA部分序列互补配对组成的复合物；其中tracrRNA负责与Cas9蛋白结合，而crRNA携带外来核酸识别序列（spacer）。基因...
CRISPR / Cas9 系统主要是由 Cas9 蛋白和单链向导 RNA (sgRNA) 组成，其中 Cas9 蛋白具有切割 DNA 双链功能，sgRNA 起导向作用。在原型间隔区相邻的基序 (protospacer adjacent motif, PAM) 存在的情况下，Cas9 蛋白能在 sgRNA 导向作用下通过碱基互补配对到达不同的靶部位，切割靶基因实现 DNA 双链断裂 (double...
2)sgRNA靶点的选择:Cas9Nuclease切割位置在待修饰位点的30bp以内,Z差保持在50bp以内。 3)sgRNA品质:sgRNA活性是影响KI的关键因素之一,因此需要提前验证其活性。 4)Cas9Nuclease形式的选择:缩短Cas9蛋白在细胞内的存续时间,可以避免连续切割和脱靶,建议使用mRNA或蛋白形式的Cas9。若采用质粒,需要确保其纯度和浓度(建议大...
CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过单向导sgRNA识别目的基因组序列,引导Cas9核酸酶对基因组进行有效切割,形成DNA双链断裂,通过细胞自身修复机制实现基因敲除、敲入、突变等,达到基因编辑目的。由于CRISPR-Cas9技术靶向灵活、编辑效率高、操作简便等特点逐步被应用于基因改造、药物开发、遗传病治疗等方面。 △图1.CRISPR/Cas9...
sgRNA在CRISPR-Cas9基因编辑系统中具有准确识别靶基因序列的作用,其效果可影响编辑的效率、是否发生脱靶等,甚至对最终基因编辑的效果产生决定性作用。因此,设计合理有效的sgRNA是我们实现基因编辑的重要基础。sgRNA包括20nt的靶向序列,crRNA,linker loop 和 tracrRNA几个部分共同...
Cas9 RNPs是通过将纯化的Cas9与体外sgRNA和核糖核蛋白(RNPs)融合形成的复合物进入细胞后立即起作用。然而,RNP由于其复杂的组成和电荷特性而相对难以递送到细胞中,而蛋白质和核酸通常使用电穿孔与细胞穿透肽的辅助。随着递送载体的不断创新,科学家们已经确定外泌体是递送...
该复合物通过sgRNA的spacer序列导引Cas9蛋白高度特异性地结合至目标DNA，触发Cas9的内切酶活性，引发目标DNA的双链断裂。细胞察觉到断裂后，启动修复机制，包括非同源末端连接和同源重组，以实现基因组的精准编辑，为疾病治疗和基因研究提供了创新性工具。一、sgRNA的设计原则 1、特异性：确保sgRNA是特异性的，以免在基因...
可以看到Cas9和sgRNA之间存在诸多相互作用: 比如sgRNA上repeat-antirepeat双螺旋结构(RAH)、茎环1、图中茎环1和茎环2的连接子区域就和Cas9通过富精氨酸的桥双螺旋还有CTD区域发生直接相互作用. 图c中缺少茎环2还有茎环3, 因此不知道它们和Cas9的作用如何, 不过DNA与Cas9结合的结构表明Cas9和茎环3之间的接触比较弱...