(3)使用体外转录试剂盒进行RNA合成: - Cas9 mRNA:需进行5'端加帽和3'端加尾修饰 - sgRNA:无需额外修饰 RNA活性检测 (1)实验组:将体外转录的sgRNA和Cas9 mRNA共注射入斑马鱼受精卵 (2)对照组:对于非斑马鱼基因,需同时注射含有靶位点的DNA片段 (3)胚胎培养24小时后,随机选取5个胚胎提取基因组DNA (4)进行PCR...
RNA体外转录（1）以构建的质粒为模板，使用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增（反应体系：20μl；循环数：30）（2）纯化PCR产物作为体外转录模板（3）使用体外转录试剂盒进行RNA合成：- Cas9 mRNA：需进行5'端加帽和3'端加尾修饰- sgRNA：无需额外修饰RNA活性检测（1）实验组：将体外转录的sgRNA和Cas9 mRNA共注射入斑马...
(3)使用体外转录试剂盒进行RNA合成: - Cas9 mRNA:需进行5'端加帽和3'端加尾修饰 - sgRNA:无需额外修饰 RNA活性检测 (1)实验组:将体外转录的sgRNA和Cas9 mRNA共注射入斑马鱼受精卵 (2)对照组:对于非斑马鱼基因,需同时注射含有靶位点的DNA片段 (3)胚胎培养24小时后,随机选取5个胚胎提取基因组DNA (4)进行PCR...
1.制备 Cas9 mRNA (1)制备 Cas9 mRNA 的体外转录模板:通过 XbaI 单酶切线性化 pSP6-2sNLS-spCas9 载体(Amp 抗性)(37 ℃,4 小时以上),取少量电泳确认线性化完全后,直接回收线性化产物。 (2)体外转录 Cas9 mRNA。 (3)添加 polyA 序列、回收可得到用于显微注射的Cas9 mRNA(添加 polyA 序列可增强 mRNA 的...
【图3】CRISPR/Cas9基因编辑原理图 正如图3所示,CRISPR/Cas9介导的基因组编辑原理很简单,但是科学家们却玩出了很多不同的花样。针对大肠杆菌,科学家们已经报道了很多基于CRISPR/Cas9的基因组编辑方法 (或protocol),我会把其中具有代表性的方法介绍给大家,这次先介绍几种基于同源重组的方法。
通常使用质粒载体或病毒载体等方法来将Cas9和sgRNA导入细胞。目前慢病毒是构建基因敲除细胞株的最佳工具，通过将编码Cas9蛋白的序列和sgRNA序列克隆至慢病毒穿梭质粒中，再用包装好的病毒感染细胞。4.实验细胞感染及基因敲除 利用慢病毒感染实验细胞，细胞成功表达Cas9和sgRNA。Cas9蛋白在sgRNA引导下对细胞基因组的靶标基因...
3.构建Cas9和sgRNA表达载体 通常使用质粒载体或病毒载体等方法来将Cas9和sgRNA导入细胞。目前慢病毒是构建基因敲除细胞株的最佳工具,通过将编码Cas9蛋白的序列和sgRNA序列克隆至慢病毒穿梭质粒中,再用包装好的病毒感染细胞。 4.实验细胞感染及基因敲除 利用慢病毒感染实验细胞,细胞成功表达Cas9和sgRNA。Cas9蛋白在sgRNA引导...
我们知道,RNAi是从mRNA水平对目的基因进行沉默,而CRISPR-Cas9是从基因组水平对目的基因进行敲除或消除目的基因在细胞内的表达,让靶蛋白的功能下调或完全丧失,Cas9靶点的选择范围相比RNAi也更加广泛,包括所有基因组序列,如外显子、内含子、启动子、增强子、基因间隔序列等。
通常使用质粒载体或病毒载体等方法来将Cas9和sgRNA导入细胞。目前慢病毒是构建基因敲除细胞株的最佳工具,通过将编码Cas9蛋白的序列和sgRNA序列克隆至慢病毒穿梭质粒中,再用包装好的病毒感染细胞。 4.实验细胞感染及基因敲除 利用慢病毒感染实验细胞,细胞成功表达Cas9和sgRNA。Cas9蛋白在sgRNA引导下对细胞基因组的靶标基因...
CRISPR protocol-Cas9介导的同源重组 汉恒生物科技(上海)有限公司 400-092-0065 地址：上海市浦东新区蔡伦路150号1号楼2楼 021-*** 邮箱：service@hanbio.net www.hanbio.net Cas9介导的同源重组